Rakotwórczy wirus odkryty w „szczepionkach” Pfizera!

24 września, 2023 admin

Fot.: Wikipedia

Japoński profesor Murakami z Uniwersytetu Tokijskiego jest zaniepokojony alarmującym odkryciem wirusa Simian Virus 40 (SV40) w fiolkach firmy Pfizer. SV40 był w przeszłości powiązany z rozwojem raka u ludzi. Odkrycie to rodzi pytania i obawy dotyczące potencjalnego ryzyka związanego z używaniem takich fiolek. Aby zrozumieć dokładny związek i potencjalny wpływ SV40 na ludzi potrzebne są dalsze badania.

„Szczepionka” Pfizera ma zdumiewający problem. Dokonałem zaskakującego odkrycia. Zamieszczona poniżej fotografia jest powiększonym widokiem sekwencji szczepionki Pfizera. Jak widać, sekwencja szczepionki Pfizera zawiera część sekwencji wirusa SV40. Sekwencja ta znana jest jako promotor. Z grubsza rzecz biorąc, promotor powoduje zwiększoną ekspresję genu. Problem polega na tym, że sekwencja ta pochodzi od znanego rakotwórczego wirusa Simian Virus 40 (SV40).

Pojawia się pytanie, dlaczego taka sekwencja, która pochodzi z wirusa rakowego, jest zawarta w szczepionce Pfizera. W szczepionce nie powinno być absolutnie żadnej potrzeby stosowania takiej sekwencji wirusa powodującego raka. Sekwencja ta jest całkowicie zbędna do produkcji szczepionek mRNA. Ale to nie jedyny problem. Jeśli taka sekwencja jest obecna w DNA, to może ono łatwo migrować do jądra komórkowego biorcy preparatu. Oznacza to, że takie DNA może łatwo dostać się do genomu osoby przyjmującej tzw. szczepionkę zawierającą mRNA, co jest bardzo niepokojące. Ważne jest, aby omawiana sekwencja została z preparatów usunięta, jednak Pfizer produkując je nie usunął rakotwórczych genomów. Jest to skandalicznie złośliwe. Podkreślam: ten typ sekwencji promotorowej jest całkowicie niepotrzebny do produkcji szczepionki mRNA, gdyż SV40 jest w rzeczywistości promotorem wirusów nowotworowych.

Japoński profesor Murakami z Uniwersytetu Tokijskiego wyraża zaniepokojenie alarmującym odkryciem promotorów wirusa Simian Virus 40 (SV40), związanego z rozwojem raka u ludzi, w fiolkach Pfizer: Szczepionka Pfizer ma oszałamiający problem. Dokonałem niesamowitego odkrycia. Wpis tej treści znalazł się na Twisterze profesora 20 maja 2023 roku.

Sekwencjonowanie dwuwalentnych szczepionek Moderna i Pfizer mRNA ujawnia nanogramowe do mikrogramowych ilości dsDNA wektora ekspresyjnego na dawkę:

Skład fiolki 1 firmy Pfizer zawiera wstawkę 72bp, która nie jest obecna w podawanym przez producenta składzie fiolki 2 firmy Pfizer. Ten indel jest znany z amplifikacji promotora SV40 i jego sygnału lokalizacji jądrowej (Dean et al. 1999) (Moreau et al. 1981) Kevin McKernan, Yvonne Helbert, Liam T. Kane, Stephen McLaughlin Medical Genomics.

Profesor Murakami z Uniwersytetu Tokijskiego nie jest jednak jedyną osobą, która potwierdziła to odkrycie: Mikrobiolog Kevin McKernan odkrył niepokojące poziomy zanieczyszczenia DNA, w tym promotory wirusa Simian Virus 40 (SV40), który został powiązany z rozwojem raka u ludzi, w fiolkach firm Pfizer i Moderna: Jest on obecny zarówno w preparatach Moderna, jak i Pfizer. Przyjrzeliśmy się szczepionkom dwuwalentnym firm Moderna i Pfizer oraz tylko szczepionkom monowalentnym firmy Pfizer, ponieważ nie mieliśmy dostępu do szczepionek monowalentnych firmy Moderna. We wszystkich trzech przypadkach szczepionki zawierają zanieczyszczenie dwuniciowym DNA. Jeśli sekwencjonujemy to DNA, okazuje się, że pasuje ono do wektora ekspresyjnego używanego do produkcji RNA…

Ilekroć widzimy zanieczyszczenie DNA, na przykład plazmidami, w preparacie do iniekcji, pierwszą rzeczą, o której ludzie myślą, jest to, czy obecna jest endotoksyna E. coli, ponieważ powoduje ona anafilaksję u osób, którym wstrzyknięto szczepionkę. Istnieje wiele przypadków anafilaksji – także w bazie danych VAERS. Można zobaczyć ludzi, którym wstrzyknięto ten lek i którzy zmarli. To może być tło tego procesu E. coli do produkcji DNA…

Przynajmniej po stronie Pfizera ma on tak zwany promotor SV40. To część onkogennego wirusa. Nie jest to cały wirus. Wiadomo jednak, że ten mały fragment powoduje bardzo agresywną ekspresję genów nowotworowych. Nawet FDA wskazała w przeszłości, że podczas wstrzykiwania dwuniciowego DNA istnieje ryzyko, że te fragmenty mogą zostać zintegrowane z ludzkim genomem. Jeśli nie zostanie zachowana ostrożność podczas tworzenia tych preparatów i dostaną się do nich nadmierne ilości tego DNA, ryzyko integracji genomu z dwoniciowym DNA wzrasta…

Jeśli umieścisz promotor SV40 przed onkogenem, nastąpi wysoka ekspresja genu, który może powodować raka, jednorazowe zdarzenie, ale nie musisz uderzać nim w wiele komórek, aby go uruchomić. SV40 miał wpływ na cały genom wirusa, a nie tylko na promotora, jednak miało to wpływ na poprzednie programy szczepień. W przypadku szczepionki przeciwko polio istniały obawy, że może ona przyczyniać się do powstawania nowotworów. Tak więc od dawna istnieją obawy dotyczące SV40.

Promotor w niektórych z tych wektorów nie jest konieczny. Wydaje się, że jest to zbędne niedopatrzenie, które można było wyeliminować, ale nadal tam jest, ponieważ tak szybko wprowadzono go na rynek, że nie było czasu na usunięcie zbędnych części plazmidu. Tak więc ten fragment DNA jest tym, na co naprawdę musimy zwracać uwagę. W tym celu opracowaliśmy ilościowe testy PCR. Kilku badaczy na całym świecie przeprowadza obecnie te testy, aby sprawdzić, ile tego DNA jest nadal obecne po zaszczepieniu ludzi.

Poniżej przedstawiamy pracę naukową na ten temat

______________________________

Sekwencjonowanie dwuwalentnych szczepionek Moderna i Pfizer mRNA ujawnia nanogramowe do mikrogramowych ilości dsDNA wektora ekspresyjnego na dawkę.

źródło

Kevin McKernan, Yvonne Helbert, Liam T. Kane, Stephen McLaughlin

Medicinal Genomics, 100 Cummings Center, Suite 406-L, Beverly Mass, 01915

Do oceny składu kwasów nukleinowych czterech przeterminowanych fiolek dwuwartościowych szczepionek mRNA firm Moderna i Pfizer wykorzystano kilka metod. Dwie fiolki od każdego dostawcy zostały ocenione za pomocą sekwencjonowania Illumina, qPCR, RT-qPCR, fluorometrii Qubit™ 3 i elektroforezy Agilent Tape Station™. Wiele testów potwierdza zanieczyszczenie DNA, które przekracza wymagania Europejskiej Agencji Leków (EMA) 330ng/mg i wymagania FDA 10ng/dawkę. Dane te mogą mieć wpływ na nadzór nad mRNA szczepionki w mleku matki lub osoczu, ponieważ testy RT-qPCR ukierunkowane na mRNA szczepionki nie mogą odróżnić DNA od RNA bez leczenia nukleazą RNase lub DNase. Podobnie, badania oceniające aktywność odwrotnej transkryptazy LINE-1 i szczepionkowego mRNA będą musiały uwzględniać wysoki poziom zanieczyszczenia DNA w szczepionkach. Dokładny stosunek liniowego pofragmentowanego DNA do nienaruszonego kolistego plazmidowego DNA jest nadal badany. Opisano ilościowe testy PCR stosowane do śledzenia zanieczyszczenia DNA.

Wprowadzenie

W kilku badaniach odnotowano przedłużoną obecność szczepionkowego mRNA w mleku matki i osoczu (Bansal et al. 2021; Hanna et al. 2022; Castruita et al. 2023). Może to wynikać ze stabilności N1-metylopseudourydyny (m1Ψ) w mRNA szczepionki. Nance i in. przedstawiają metodę syntezy mRNA szczepionki wykorzystujące plazmid dsDNA, który jest najpierw amplifikowany w E. coli przed syntezą mRNA szczepionki in vitro przy użyciu polimerazy T7 (Nance i Meier 2021). Nieusunięcie tego DNA może skutkować wstrzyknięciem kwasów nukleinowych kodowanych przez białka kolca, które są bardziej stabilne niż zmodyfikowany RNA. EMA określiła limity na poziomie 330ng/mg DNA do RNA (Josephson 2020-11-19). FDA wydała wytyczne dla dawek poniżej 10ng/dawkę w szczepionkach (Sheng-Fowler et al. 2009).
Pozostałości wstrzykniętego DNA mogą powodować reakcje interferonu typu I i zwiększać potencjał integracji DNA (Ulrich-Lewis i in. 2022).

Wyniki

Aby ocenić skład kwasów nukleinowych szczepionek, DNA szczepionki zostało głęboko zsekwencjonowane przy użyciu dwóch różnych metod. W pierwszej metodzie wykorzystano komercyjnie dostępną metodę RNA-seq firmy New England Biolabs, która sprzyjała sekwencjonowaniu RNA, ale nadal zapewniała ponad 500-krotne pokrycie dla nieoczekiwanych wektorów DNA (rysunek 1 i 2). Zespoły RNA-seq miały skrócone trakty poli A w porównaniu z konstruktami opisanymi przez Nance’a i in. Druga metoda wyeliminowała RNA za pomocą RNazy A i sekwencjonowała tylko DNA przy użyciu zestawu biblioteki fragmentów Watchmaker Genomics. Zespoły skoncentrowane na DNA dostarczyły grupy wektorów z bardziej nienaruszonymi łańcuchami poli A (rysunek 3). Zostały one wykorzystane do zaprojektowania multipleksowych testów qPCR i RT-qPCR, które są ukierunkowane na sekwencję białka spike obecną zarówno w mRNA „szczepionki”, jak i wektorze DNA, a także na sekwencję pochodzenia replikacji obecną tylko w wektorze DNA (rysunek 3). Zespół fiolki 1 firmy Pfizer zawiera insercję 72bp, która nie występuje w zespole fiolki 2 firmy Pfizer. Wcięcie to jest znane ze swojego wzmocnienia do promotora SV40 i jego sygnału lokalizacji jądrowej (Dean i wsp. 1999) (Moreau i wsp. 1981).

Rysunek 1. Zespół wektora Moderna biblioteki RNA-seq z wstawką kolca (czerwony), genem oporności na kanamycynę (zielony) napędzanym promotorem AmpR i bakteryjnym źródłem replikacji o wysokiej kopii (żółty).

Rysunek 2. Zestawienie biblioteki RNA-seq szczepionki dwuwalentnej Pfizer. Z adnotacją SEB/FCS, wstawką białka kolca (czerwony), bakteryjnym źródłem replikacji (żółty), genem oporności Neo/Kan (zielony), źródłem F1 (żółty) i promotorem SV40 (żółty i biały).

Rysunek 3. Szczepionki poddane działaniu RNazy zostały zsekwencjonowane za pomocą Illumina (RNase-Seq nie RNA-seq). Wektory Pfizer z fiolki 1 (po lewej) i fiolki 2 (po prawej) zawierają różnicę 72bp w promotorze SV40 (zielona i jasnoniebieska adnotacja). Testy qPCR są przedstawione na różowo jako sonda Spike i sonda Ori. Sekwencjonowanie RNazy zapewniło lepszą rozdzielczość miejsca linearyzacji Eam1104i i sekwencji adenylacji Poly. Wektory różnią się długością ogona polyA (prawdopodobny artefakt sekwencjonowania) i indel 72bp.

Rysunek 4. Lokalne wyrównanie wektorów Pfizer fiolka 1 do Pfizer fiolka 2 podkreśla na niebiesko duplikację tandemową 72bp.

Rysunek 5A. Dokładna inspekcja Integrative Genome Viewer (IGV) pokazuje pojawienie się insercji 72bp, która jest heteroplazmatyczna w fiolce Pfizer 2. Widok IGV w lewym górnym rogu jest widokiem powiększonym, w którym kolorowe znaki przedstawiają indel. Dolny lewy widok IGV pokazuje odwrócone sparowane odczyty, ponieważ insercja 72bp jest powtórzeniem tandemowym, a sparowane odczyty krótsze niż 72bp mogą być mapowane na dwa różne sposoby. Widok IGV w prawym górnym rogu pokazuje spiętrzenie pokrycia odczytów lub „Plateau”. Dzieje się tak, gdy referencja ma jedną kopię powtórzenia 72bp, a próbka ma 2 kopie. Uwaga – w prawym górnym widoku IGV sekwencja w fiolce 1 znajduje się w odwrotnej orientacji w IGV niż w fiolce 2. Prawy dolny widok IGV jest powiększonym widokiem prawego górnego ekranu IGV.

Ponieważ dwie fiolki firmy Pfizer mają ten sam numer partii, znalezienie heterozygotycznej zmiany liczby kopii między dwiema fiolkami jest nieoczekiwane. Postawiono hipotezę, że pojawienie się heteroplazmatycznej zmiany liczby kopii jest zamiast tego wynikiem złożenia przez asembler Megahit tego, co w rzeczywistości jest dwiema kopiami sekwencji 72bp w jedną kopię ze względu na zbyt krótkie rozmiary wstawek w bibliotekach sekwencjonowania (105bp). Warto zauważyć, że dłuższe sparowane odczyty w bibliotece rozwiązują powtórzenie tandemowe 72bp.
Gdy referencje mają pojedynczą kopię powtórzenia 72bp, a próbka ma dwie kopie powtórzenia, odczyty powinny układać się w stos do dwukrotnego pokrycia w stosunku do pojedynczej kopii 72bp loci, jak pokazano na rysunku 5A. Aby przetestować tę hipotezę, dodaliśmy drugą sekwencję 72bp do krótszego zestawu plazmidów i zaobserwowaliśmy, że odczyty mapują się bez artefaktów i bez dowodów na heteroplazmię (rysunek 5B).

Rysunek 5B. Widok IGV pokrycia odczytu nad Pbiv2_k141_23 pokazuje dyskretne plateau pokrycia 72bp (czerwony prostokąt). Edycja odniesienia Pbiv2_k141_23 w celu uwzględnienia 2 kopii sekwencji 72bp i ponowne mapowanie danych sekwencji do tej skorygowanej sekwencji pokazuje, że pokrycie obu wektorów jest bardziej normalne, bez plateau pokrycia w fiolce 2 Pfizer.

Dane te wskazują, że wszystkie wektory firmy Pfizer zawierają homoplastyczną 2 kopię 72bp SV40 Enhancer związaną z silniejszą ekspresją i lokalizacją jądrową. Początkowy heteroplastyczny indel był artefaktem asemblera Megahit i bibliotek krótkich wstawek.

Aby oszacować rozmiar DNA, oczyszczone szczepionki oceniono na Agilent Tape Station™ przy użyciu taśm do elektroforezy DNA (taśmy do przesiewania genomowego DNA) i RNA (taśmy RNA o wysokiej czułości).

Elektroforeza Agilent Tape Station™ ujawnia 7,5 – 11,3 ng/µl dsDNA w porównaniu do 23,7 – 55,9ng/µl mRNA wykrytego w każdej próbce 300µl. Fluorometria Qubit™ 3 oszacowała 1-2,8 ng/µl DNA i 21,8-52,8 ng/µl RNA. W elektroforezie DNA widoczna jest większa fragmentacja. Całkowite poziomy RNA są niższe niż przewidywane dawki 30ug (100ng/µl) i 100ug (200ng/µl), co sugeruje utratę wydajności izolacji DNA i RNA, odchylenia produkcyjne lub rozpad RNA w przeterminowanych partiach.

Rysunek 6. Elektroforeza Agilent Tape Station™ wykazuje 23,7ng/µl – 55,9ng/µl RNA (po lewej). 7,5ng-11,3ng/µl zaobserwowano na DNA opartym na Tape Station™. Podczas gdy elektroforegram DNA pokazuje pik sugerujący plazmid pełnej długości, wiadomo, że próbka ta zawiera duże ilości RNA N1-metylopseudourydyny. Hybrydy DNA z mRNA N1-metylopseudourydyny mogą zapewnić wystarczającą ilość barwnika interkalującego do wytworzenia piku. Rozmiar piku na taśmie RNA po lewej stronie jest krótszy niż oczekiwano. Może to być wynikiem zmiany struktury drugorzędowej lub stosunku masy do ładunku DNA przez metylopseudourydynę N1.

Ilościowe testy PCR zostały zaprojektowane przy użyciu oprogramowania IDT Primer Quest ukierunkowanego na region w białku kolca, który był identyczny między sekwencjami tego białka firm Moderna i Pfizer oraz wspólną sekwencją w pochodzeniu replikacji wektorów. Umożliwiło to ocenę “szczepionek” metodą qPCR i RT-qPCR. qPCR amplifikuje tylko DNA, podczas gdy RT-qPCR amplifikuje zarówno DNA, jak i RNA. Gradientowy qPCR został wykorzystany do zbadania warunków, w których oba cele działałyby w tych samych warunkach cyklicznych zarówno dla RT-qPCR, jak i PCR (dane gradientowego PCR nie zostały pokazane).

Rycina 7. qPCR dwuwartościowej szczepionki Pfizer z i bez DNazy I (po lewej) i RNazy A (po prawej). Nietraktowane mRNA wykazuje równe CT dla testów Spike i Vector, zgodnie z oczekiwaniami. Vector jest bardziej wrażliwy na DNazę I niż Spike, co sugeruje, że modRNA może hamować aktywność nukleazy DNazy I przeciwko komplementarnym celom DNA. Leczenie RNazą A nie zmienia sygnału qPCR.

Rysunek 8. RT-qPCR amplifikuje zarówno DNA, jak i RNA. Nieleczone próbki wykazują duże przesunięcie CT w testach Pfizer Spike i Vector (lewy niebieski kontra zielony). Jest to oczekiwane, ponieważ polimeryzacja T7 powinna wytworzyć więcej mRNA nad kolcem niż nad wektorem. Niewielkie przesunięcia 1-2 CT są widoczne przy traktowaniu DNazą I. Jest to oczekiwane, jeśli DNA ma mniej niż równe stężenie kwasu nukleinowego w RT-PCR. Traktowanie RNazą (po prawej) pokazuje przesunięcie o 10 CT, ale nie zmienia CT wektora DNA.

Rysunek 9. 1 µl dwuwalentnej szczepionki Pfizer umieszczony w 100 µl buforu do lizy liści w 8-minutowym etapie gotowania zapewnia CT równe 24 zarówno dla celów Vector, jak i Spike w qPCR (po lewej). Test reaguje na 1,5,10 µl danych wejściowych (po prawej).

Rysunek 10. 1 µl dwuwalentnej szczepionki Pfizer umieszczony w 100 µl buforu do lizy liści w 8-minutowym etapie gotowania zapewnia CT 20 i 12 dla celów Vector i Spike w RT-qPCR (po lewej). Test reaguje na 1,5,10 µl danych wejściowych (po prawej).

Rysunek 11. 1 µl dwuwalentnej szczepionki Moderna wykazuje różne wartości CT dla kolca i celów wektorowych (po lewej) z qPCR. Należy to dalej zbadać, ponieważ testy zapewniają równe wyniki CT dla szczepionek Pfizer, a sekwencja amplikonu jest identyczna między dwoma źródłami wektora. Istnieją 2 niedopasowania w amplikonach spike między Moderna i Pfizer, ale żadne z niedopasowań nie znajduje się pod starterem lub sondą. Test reaguje na 1,5,10 µl bezpośrednio gotowanego mRNA (po prawej).

Rysunek 12. 1 µl dwuwalentnej szczepionki Moderna wykazuje różne wartości CT dla celów Spike i Vector (po lewej) z RT-qPCR. Duże przesunięcie o 10 CT między kolcem a wektorem należy wziąć pod uwagę, że kontrola qPCR wykazuje przesunięcie o 5 CT. Preparaty do gotowania mogą tolerować 1-10 µl szczepionki (środkowy i prawy).

Tabela 1. Fluorometria Qubit™ 3 szacuje 1,04-2,8 ng/µl dsDNA w szczepionkach i 21,8ng-52,8ng/µl RNA.

Syntetyczne szablony zostały zsyntetyzowane za pomocą IDT w celu zbudowania krzywych standardowych RT-qPCR w celu porównania CT z masą DNA w reakcji. Metoda ta wykorzystuje idealne szablony i nie kwantyfikuje cząsteczek DNA mniejszych niż rozmiar amplikonu. Zgodnie z oczekiwaniami, metoda ta zapewnia niższe szacunki stężenia DNA niż fluorometria Qubit™ 3 lub Agilent Tape Station™. Reprezentuje również idealne środowisko, które nie wychwytuje inhibicji lub wyczerpania starterów, które mogą wystąpić, gdy duże ilości mRNA o identycznej sekwencji jak cel DNA są współobecne w teście qPCR.

Rysunek 13. Dwa gBlocki zostały zsyntetyzowane w IDT dla szablonów kontroli pozytywnej Spike i Ori używanych w testach RT-qPCR. 10-krotne seryjne rozcieńczenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach, aby skorelować wyniki CT z pikogramami DNA. Próg został obniżony ze 102 do przeglądu tła. CT ~20 = 500fg/RT-qPCR reakcji. Ponieważ cele 100bp stanowią tylko 1/80 wektorowego DNA obecnego jako potencjalne zanieczyszczenie, 500 fg/µl przejawia się w 40pg/µl wektorowego DNA. Jakikolwiek DNA poddany działaniu DNazy I i mniejszy niż rozmiar amplikonu nie może być amplifikowany ani oznaczany ilościowo za pomocą tej metody. Metoda ta będzie oznaczać ilościowo próbki poddane działaniu DNazy I w porównaniu do Qubit™ 3 lub Agilent Tape Station™.

Praca ta została dodatkowo zweryfikowana poprzez przetestowanie 8 nieotwartych monowalentnych szczepionek Pfizer zarówno za pomocą qPCR, jak i RT-qPCR.

Rysunek 14. Dwuwalentne szczepionki Moderna i Pfizer (u góry). 8 Jednowartościowe szczepionki Pfizer mRNA. Były to nieotwarte, ale przeterminowane szczepionki (na dole).

Rysunek 15. 1 µl szczepionki gotowanej w 100 µl buforu do lizy liści poddano qPCR (po lewej) i RT-qPCR (po prawej) dla Vector (czerwony) i Spike (niebieski). Przetestowano 8 próbek w trzech egzemplarzach.

Tabela 2. Wartości CT dla Spike i Vector podczas qPCR (tylko DNA). Odchylenie standardowe dla potrójnych pomiarów zaznaczono poziomo czarną czcionką. Odchylenie standardowe dla poszczególnych fiolek zaznaczono pionowo na czerwono. Delta CT lub (Vector CT minus Spike CT) reprezentuje stosunek Spike do Vector DNA i powinien = 1.

Tabela 3. Wartości CT dla Spike i Vector podczas RT-qPCR (RNA + DNA). Stosunek RNA:DNA waha się od 43:1 do 161:1. Dopuszczalny limit EMA wynosi 30-30:1. Jest to 18-70-krotne przekroczenie limitu EMA.

Dyskusja

Wiele metod wskazuje na wysoki poziom zanieczyszczenia DNA zarówno w szczepionkach monowalentnych, jak i dwuwalentnych. Podczas gdy Qubit™ 3 i Agilent Tape Station™ różnią się pod względem bezwzględnej kwantyfikacji, obie metody wykazują, że jest ona o rzędy wielkości wyższa niż limit EMA wynoszący 330ng DNA / 1mg RNA. qPCR i RT-qPCR potwierdzają względny stosunek RNA do DNA. Przesunięcie 11-12 CT powinno być widoczne między sygnałami Spike i Vector RT-qPCR, aby reprezentować limit zanieczyszczenia 1:3030 (2^11,6 = 3100). Zamiast tego obserwujemy znacznie mniejsze przesunięcia CT (5-7 CT) podczas analizy danych qPCR i RT-qPCR z tymi szczepionkami. Należy zauważyć, że metody Qubit™ 3 i Agilent barwią całe DNA w roztworze, podczas gdy qPCR mierzy tylko amplifikowalne cząsteczki bez miejsc cięcia DNazą I między starterami. Im dalej od siebie znajdują się startery qPCR, tym mniej wykrywalnych cząsteczek Qubit™ 3 i Agilent ulegnie amplifikacji. Startery użyte w tym badaniu są oddalone od siebie o 106bp i 114bp, a zatem wszelkie cząsteczki, które są cięte DNazą I poniżej tej długości, będą zaniżone w metodach qPCR w stosunku do bardziej ogólnych pomiarów dsDNA z Qubit™ 3 lub Agilent Tape Station™.

Oznacza to również, że krzywe wzorcowe qPCR wykorzystujące w 100% nienaruszone wzorce syntetycznego DNA będą amplifikować bardziej wydajnie, a tym samym zaniżać całkowite zanieczyszczenie strawionym DNA. Na przykład, krzywe standardowe z syntetycznymi wzorcami 106-114bp zapewniają CT poniżej 20 w zakresie pikogramów (nie w zakresie niskich nanogramów), co sugeruje, że duże części biblioteki są mniejsze niż minimalny rozmiar amplifikacji. Czyste wzorce nie zawierają również wysokich stężeń zmodyfikowanego mRNA o identycznej sekwencji, które mogłyby służyć jako konkurencyjny pochłaniacz starterów lub inhibitor metod qPCR.

Alternatywnie, Qubit™ 3 i Agilent Tape Station™ mogą zawyżać kwantyfikację DNA z powodu interkalacji barwnika z RNA N1-metylopseudourydyny. Z tego powodu uważamy, że stosunek, który zaobserwowaliśmy, gdy cząsteczki te są bardziej skrupulatnie badane za pomocą polimeraz specyficznych dla każdego typu matrycy w qPCR i RT-qPCR, jest bardziej odpowiednią miarą. Metryka EMA jest również określana jako taki stosunek. Zwraca to również uwagę na to, czy powyższe limity EMA uwzględniają charakter zanieczyszczeń DNA. Wydaje się, że replikacyjnie kompetentne DNA powinno mieć prawdopodobnie bardziej rygorystyczne limity. DNA z promotorami ssaków lub genami oporności na antybiotyki może również budzić większe obawy niż tylko losowe genomowe DNA E. coli z preparatu plazmidowego (Sheng-Fowler et al. 2009). Tło DNA E. coli zostało zmierzone za pomocą qPCR i miało CT powyżej 35.

W ramach badań nad wirusem SAR-CoV-2 odbyto debatę na temat jego zdolności do integracji z ludzkim genomem (Zhang i in. 2021). Praca ta zainspirowała pytania dotyczące zdolności tzw. szczepionek mRNA do integracji z ludzkim genomem. Takie zdarzenie wymagałoby odwrotnej transkrypcji mRNA do DNA napędzanej przez LINE-1, jak opisali Alden i wsp. (Alden i wsp. 2022). Zanieczyszczenie dsDNA sekwencją kodującą białko kolca nie wymagałoby LINE-1 do odwrotnej transkrypcji, a obecność sygnału lokalizacji jądrowej SV40 w wektorze szczepionki Pfizer dodatkowo zwiększyłaby szanse na integrację z ludzkim genomem.

Niniejsza praca ta nie przedstawia dowodów na integrację z ludzkim genomem, ale biorąc pod uwagę poziomy dsDNA w tych “szczepionkach” podkreśla, że aktywność LINE-1 nie jest wymagana. Należy również zweryfikować lokalizację jądrową tych wektorów.

Wcześniejsze sekwencjonowanie szczepionek monowalentnych z Jeong et al. opublikowało jedynie sekwencję konsensusu (Dae-Eun Jeong 2021). Surowe odczyty dla tego projektu nie są dostępne i należy je przeanalizować pod kątem obecności sekwencji wektora.

Biorąc pod uwagę, że “szczepionki mRNA” przekraczają limity EMA (330ng/mg DNA/RNA) z danymi Qubit™ 3 i Agilent, a dane te przekraczają również limit FDA (10ng/dawkę) z bardziej konserwatywnymi krzywymi standardowymi qPCR, powinniśmy ponownie przeanalizować poziomy lipopolisacharydu (LPS). Zanieczyszczenia plazmidowe z preparatów E. coli są często zanieczyszczone LPS. Zanieczyszczenie endotoksynami może prowadzić do anafilaksji po wstrzyknięciu (Zheng et al. 2021).

Ograniczeniem opisywanego badania jest nieznane pochodzenie badanych fiolek ze “szczepionką”. Fiolki te zostały wysłane do nas anonimowo pocztą bez zimnych opakowań. Wiadomo, że RNA ulega degradacji szybciej niż DNA i możliwe jest, że niewłaściwe przechowywanie może spowodować szybszą degradację RNA niż DNA. RNA jako cząsteczka jest bardzo stabilny, ale w obecności metali i ciepła lub wszechobecnych RNaz może ulec bardzo szybkiej degradacji. Wszystkie szczepionki w tym badaniu przekroczyły datę ważności podaną na fiolce, co sugeruje, że potrzeba więcej pracy, aby zrozumieć stosunek DNA do RNA w świeżych partiach. Publikacja tych starterów qPCR może pomóc w badaniu dodatkowych partii z bardziej kontrolowanymi łańcuchami dostaw. Badania oceniające trwałość szczepionki w mleku matki lub osoczu mogą skorzystać z nadzoru DNA wektora, ponieważ sekwencja ta jest unikalna dla “szczepionki” i może utrzymywać się dłużej niż mRNA.

Podczas gdy sekwencjonowanie zapewniło pełne pokrycie szkieletów plazmidów, zwyczajowo montuje się plazmidy z pofragmentowanych bibliotek DNase I. Metody te nie określiły stosunku liniowego i kolistego DNA w fiolkach. Podczas gdy plazmidowe DNA jest bardziej kompetentne i stabilne, liniowe DNA może wiązać się z wyższym ryzykiem integracji genomu.

Wiadomo, że barwniki interkalujące stosowane w systemach Qubit™ 3 i Agilent mają niską fluorescencję krzyżową z DNA i RNA, ale nie wiadomo, w jakim stopniu N1-metylopseudourydyna zmienia specyficzność tych barwników interkalujących. W rezultacie oparliśmy się na przesunięciach CT między RT-qPCR i qPCR z sekwencją wektora i kolca jako najlepszej względnej ocenie regulacji metrycznej stosunku EMA. Te odczynniki qPCR i RT-qPCR mogą być przydatne w śledzeniu tych zanieczyszczeń w szczepionkach, bankach krwi lub tkankach pacjentów w przyszłości.

Metody
Oczyszczanie mRNA z LNPs

Oczyszczanie LiDs/SPRI

Pobrano 100 µl z każdej fiolki (1/3 do 1/5 dawki).

– 5µl 2% LiDs dodano do 100µl szczepionki w celu rozpuszczenia LNPs.

– 100 µl 100% izopropanolu

– 233 µl Ampure (Beckman Genomics)

– 25µl 25mM MgCl2 (New England Biolabs)

Próbki wymieszano 10-krotnie i inkubowano przez 5 minut w celu związania kulek magnetycznych. Kulki magnetyczne oddzielono na 96-dołkowej płytce magnetycznej na 10 minut i przemyto dwukrotnie 200 µl 80% EtOH. Kulki pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty i eluowano w 100 µl ddH20. 2 µl eluowanej próbki poddano działaniu Agilent Tape Station™.

Oczyszczanie szczepionek metodą CTAB/Chloroform/SPRI

Odnotowano pewną zmienność w wydajności qPCR w przypadku naszej metody oczyszczania szczepionek LiDs/SPRI. Niektóre próbki pozostawały nieprzezroczyste i mogły reprezentować pozostałości LNP w oczyszczaniu. Aby temu zaradzić, zoptymalizowano izolację CTAB/Chloroform/SPRI i wykorzystano ją do dalszego qPCR i elektroforezy Agilent. W skrócie, 300 µl szczepionki dodano do 500 µl CTAB (roztwór MGC A w zestawie do oczyszczania SenSATIVAx MIP. #420004). Próbkę następnie worteksowano i ogrzewano przez 5 minut w temperaturze 37°C. Dodano 800 µl chloroformu, worteksowano i wirowano z prędkością 19 000 obrotów na minutę przez 3 minuty. Górne 250 µl fazy wodnej zebrano i dodano do 250 µl roztworu B i 1 ml magnetycznego buforu wiążącego. Próbki worteksowano i inkubowano przez 5 minut, a następnie oddzielono magnetycznie. Supernatant usunięto, a kulki przemyto dwukrotnie 70% etanolem. Próbki ostatecznie eluowano w 300 µl buforu elucyjnego MGC.

Proste przygotowanie wrzątku do oceny qPCR szczepionki:

Ten proces przygotowania do wrzenia polega po prostu na pobraniu 1-10 µl szczepionki i rozcieńczeniu jej w buforze do lizatu listków kompatybilnych z PCR i podgrzaniu go (numer części Medicinal Genomics 420208).

– 65°C przez 6 minut

– 95°C przez 2 minuty

Budowa biblioteki do sekwencjonowania

50 µl każdej próbki o objętości 100 µl przekształcono w biblioteki RNA-Seq do sekwencjonowania Illumina przy użyciu zestawu NEB NEBNext UltraII Directional RNA library Kit for Illumina (NEB#E7760S).

Aby wzbogacić biblioteki o dłuższe wstawki, czas fragmentacji został skrócony z 15 minut do 10 minut, a czas syntezy pierwszej nici został wydłużony w temperaturze 42°C do 50 minut zgodnie z zaleceniami dotyczącymi długich wstawek zawartymi w protokole.
Nie przeprowadzono usuwania Ribo ani wzbogacania PolyA, aby zapewnić najbardziej obiektywną ocenę wszystkich fragmentów w bibliotece. Bibliotekę amplifikowano przez 16 cykli zgodnie z protokołem producenta. Do oceny jednoniciowego charakteru mRNA zastosowano metodę kierunkowej konstrukcji biblioteki. Jest to ważny wskaźnik jakości w dokumentach ujawniających EMA i TGA, ponieważ dsRNA (>0,5%) może indukować wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Zawartość dsRNA jest często szacowana za pomocą testu ELISA. Sekwencjonowanie kierunkowe DNA oferuje bardziej kompleksową metodę jego szacowania i zostało wcześniej zmierzone i 99,99% w Jeong et al. Nie jest jasne, w jaki sposób może się to różnić w zależności od partii lub w ramach nowego procesu produkcyjnego dla nowszych szczepionek dwuwartościowych.

Traktowanie szczepionek RNazą A

RNaza A rozszczepia zarówno uracyl, jak i cytozynę. Wiadomo, że N1-metylopseudouracyl jest odporny na RNAzę-L, ale RNaza A rozszczepia cytozyny, które nadal istnieją w mRNA. Pozostawia to głównie DNA do sekwencjonowania. Szczepionkowe mRNA, które zostało wcześniej zsekwencjonowane i omówione tutaj, było traktowane w temperaturze 37°C przez 30 minut 10 µl 20 jednostek/µl Monarch RNase A firmy NEB. Reakcja RNazy została oczyszczona przy użyciu 1,5X SenSATIVAx (Medicinal Genomics #420001). Próbki eluowano w 20 µl ddH20 po oczyszczeniu DNA. Do sekwencjonowania DNA użyto 15 µl.

Traktowanie szczepionek DNazą

50 µl szczepionki oczyszczonej CTAB poddano działaniu 2 µl DNazy I i 6 µl buforu DNazy I (Grim reefer MGC#420143) w temperaturze 37°C przez 30 minut. W celu zatrzymania reakcji DNazy dodano 2,5 µl buforu LiDs Lysis. Reakcje oczyszczono przy użyciu 60 µl 100% izopropanolu, 140 µl Ampure, 15 µl MgCl2. Kulki magnetyczne wymieszano 10 razy, pozostawiono na 5 minut do inkubacji, oddzielono magnetycznie, a następnie dwukrotnie przemyto 80% EtOH.

Strzałkowanie całego genomu szczepionek RNase’d

15 µl DNA przekształcono w biblioteki gotowe do sekwencjonowania przy użyciu zestawu do tworzenia bibliotek WGS Watchmakers Genomics. Zestaw ten dodatkowo fragmentuje DNA do mniejszych rozmiarów, co sprawia, że długość fragmentów w szczepionkach jest trudna do przewidzenia.

Fluorometria Qubit™ 3

Fluorometrię Qubit™ 3 przeprowadzono przy użyciu zestawu Biotum AccuBlue RNA Broad Range (#31073) i zestawu Biotum AccuGreen High Sensitivity dsDNA Quantitation Kit (#31066) zgodnie z instrukcjami producenta.

E.coli qPCR

Zastosowano test Medicinal Genomics PathoSEEK™ E.coli Detection (#420102) zgodnie z instrukcjami producenta.

Test qPCR i RT-qPCR Spike Assay

– MedGen-Moderna_Pfizer_Janssen_Vax-Spike_Forward

– >AGATGGCCTACCGGTTCA

– MedGen-Moderna_Pfizer_Janssen_Vax-Spike_Reverse

– >TCAGGCTGTCCTGGATCTT

– MedGen-Moderna_Pfizer_Janssen_Vax-Spike_Probe

– >/56-FAM/CGAGAACCA/ZEN/GAAGCTGATCGCCAA/3IABkFQ/

Test qPCR i RT-qPCR Vector Origin Assay

– MedGen_Vax-vector_Ori_Forward

– >CTACATACCTCGCTCTGCTAATC

– MedGen_Vax-vector_Ori_Reverse

– GCGCCTTATCCGGTAACTATC

– MedGen_Vax-vector_Ori_Probe

– /5HEX/AAGACACGA/ZEN/CTTATCGCCACTGGC/3IABkFQ/

Wyeluowano starter do 100uM zgodnie z instrukcjami IDT. Przygotowano 50X mieszaninę primer-sonda.

25µl 100uM startera do przodu
25µl 100uM Reverse Primer
12,5 µl 100uM sondy
37,5 µl wolnego od nukleazy ddH20.

Użyto 15 µl tej mieszaniny w konfiguracji mieszanki głównej qPCR przedstawionej poniżej. (0,5 µl startera/sondy na reakcję). Użyto 10 µl tej mieszaniny w konfiguracji mieszaniny wzorcowej RT-qPCR przedstawionej poniżej.

Użyte zestawy Medicinal Genomics Master Mix

https://store.medicinalgenomics.com/qPCR-Master-Kit-v3-200-rxns
https://store.medicinalgenomics.com/pathoseek-rt-qpcr-master-kit
Konfiguracja reakcji dla 30 reakcji qPCR

– 114 µl mieszaniny enzymów (zielona probówka)

– 24 µl buforu reakcyjnego (niebieska probówka)

– 246µl wolnego od nukleazy ddH20

– 15µl zestawu Primer-Probe Spike

– 15µl zestawu Primer-Probe Ori

Użyto 13,8 µl powyższej mieszaniny MasterMix i 5 µl oczyszczonej próbki (1 µl Vax DNA/RNA + 4 µl ddH20, jeśli CT <15).

Konfiguracja reakcji dla 34 reakcji RT-qPCR

200µl mieszaniny enzymów
96µl ddH20 wolnego od nukleazy
20µl inhibitora RNazy (fioletowa probówka)
4µl DTT (zielona probówka)
10µl Zestaw Primer-Probe Spike
10µl zestawu Primer-Probe Ori
10µl MasterMix i 1µl Vax DNA/RNA

Użyto zestawu do oczyszczania DNA Medicinal Genomics MIP

https://store.medicinalgenomics.com/SenSATIVAx-DNA-Extraction-Kit-200-reactions_2

Metody izolacji DNA/RNA oparte na CTAB/Chloroform/SPRI opisano powyżej.

Warunki cyklu

Warunki te działają zarówno dla qPCR, jak i RT-qPCR. Uwaga: Etap RT w temperaturze 50°C można pominąć w przypadku qPCR. Zastosowane zestawy MGC qPCR MasterMix zawierają enzym gorącego startu, na który ten etap 50°C nie ma wpływu. W celu kontroli porównań RNA z DNA, umieściliśmy testy qPCR i RT-qPCR na tej samej płytce i uruchomiliśmy poniższy program z etapem RT dla wszystkich próbek.

Warunki cyklu używane do qPCR i RT-qPCR

Sekwencje amplikonów dla kontroli pozytywnych gBlock. Ori = 106bp, Spike = 114bp.

Cel Ori

HYPERLINK „https://substackcdn.com/image/fetch/f_auto,q_auto:good,fl_progressive:steep/https://substack-post-media.s3.amazonaws.com/public/images/133b47fa-a652-4948-be59-352d2decc83f_1946x266.png” \t „_blank”

Spike target

HYPERLINK „https://substackcdn.com/image/fetch/f_auto,q_auto:good,fl_progressive:steep/https://substack-post-media.s3.amazonaws.com/public/images/b3befc1d-f66a-41f8-8e33-4ed56aa1c50f_2606x602.png” \t „_blank”

Dane sekwencjonowania

Surowe odczyty Illumina RNA-seq

Odczytane pliki są sprawdzane za pomocą algorytmu sha256 (Hash and stash) i umieszczane w łańcuchu bloków DASH. Hash sha256 odczytanego pliku jest zapisywany w OP_RETURN niezmiennej księgi. Jeśli hash pliku nie jest zgodny z hashem w tych transakcjach, plik został zmodyfikowany.

________________________________________
Zespoły Megahit

Odczyty Illumina zmapowane z powrotem do Megahit Assemblies

________________________________________

Q30 Filtered Illumina Reads (użyto ich do oszacowania poziomu błędu transkrypcji)

FastQ-Filter download: use> fastq-filter -e 0.001 -o output.fastq input.fastq

Pliki Q30 BAM. Odczyty Q30 zmapowane względem złożeń Megahit

________________________________________

Błąd IGVtools według bazy w odczytach q30

Fields = Pozycja w kontigu, pozycja prawidłowa (+)A, +C, +G, +T, +N, +Usunięcie, +Wstawianie, pasmo ujemne -A, -C, -G, -T, -N, -Usunięcie, -Wstawienie

Przebieg analizy

Odczyty zostały zdemultipleksowane i przetworzone za pomocą oprogramowania:

Trimgalore – Removes Illumina Sequencing adaptors.
Megahit– assembles reads into contigs.
Megahit for SARs-CoV-2
Samtools– generates BAM files for viewing in IGV.
Samtools stats used to calculate outie reads.
BWA-mem– Short read mapper used to align reads back to the assembled references.
SnapGene software- (www.snapgene.com)- Used to visualize and annotate expression vectors
IGV– Integrated Genome Viewer used to visualize Illumina sequencing reads.

________________________________________

Biblioteki poddane działaniu RNazy – pliki BAM specyficzne dla kontigów pliki BAM zostały utworzone przy użyciu:

Samtools;
samtools view -h input.bam contig_name -O BAM > contig.bam; samtools index contig.bam;
Samtools stats działa na każdym kontigu w każdym złożeniu.

for out_prefix in `ls *.sort.bam | perl -pe „s/.sort.bam//”`; do mkdir -p ${out_prefix}-samtools-stats; for contig in `samtools view -H ${out_prefix}.sort. bam | grep „^@SQ” | cut -f 2 | perl -pe „s/SN\://”`; do echo „Now calculating stats for ${contig}/$out_prefix…”; samtools stats ${out_prefix}.sort.bam $contig > ${out_prefix}-samtools-stats/${contig}-samtools-stats.txt; done; done

Wkład autorski

KJM – skonstruował biblioteki sekwencjonowania, zaprojektował testy qPCR, uruchomił Qubit ™ 3s i Agilent Tape Station ™ i przeprowadził analizę, zredagował manuskrypt.
YH – zoptymalizował izolacje DNA, Tape Station™ i wyniki qPCR.
SM, LTK – pomagali w demultipleksowaniu i przycinaniu odczytów oraz rozwiązywaniu problemów z montażem.

Konflikt interesów – Autorzy niniejszego artykułu są pracownikami firmy Medicinal Genomics, która jest producentem niektórych zestawów do qPCR i izolacji DNA wykorzystanych w tym badaniu.

Podziękowania
Dziękujemy Lei Zhang za zorganizowanie outsourcingu sekwencjonowania. Chcielibyśmy podziękować Jessice Rose, Sabine Hazan, Jikkyleaks, Pathogenetics, Steve Massey, Valentine Bruttel, Lynn Fynn, Sasha Letypova, David Wiseman i Pharmacoconuts za pomocne komentarze na ten temat.

Bibliografia

Alden M, Olofsson Falla F, Yang D, Barghouth M, Luan C, Rasmussen M, De Marinis Y. 2022. Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line. Curr Issues Mol Biol 44: 1115-1126.
Bansal S, Perincheri S, Fleming T, Poulson C, Tiffany B, Bremner RM, Mohanakumar T. 2021. Cutting Edge: Circulating Exosomes with COVID Spike Protein Are Induced by BNT162b2 (Pfizer-BioNTech) Vaccination prior to Development of Antibodies: A Novel Mechanism for Immune Activation by mRNA Vaccines. J Immunol 207: 2405-2410.
Castruita JAS, Schneider UV, Mollerup S, Leineweber TD, Weis N, Bukh J, Pedersen MS, Westh H. 2023. SARS-CoV-2 spike mRNA vaccine sequences circulate in blood up to 28 days after COVID-19 vaccination. APMIS 131: 128-132.
Dae-Eun Jeong MM, Karen Artiles, Orkan Ilbay, Andrew Fire*, Kari Nadeau, Helen Park, Brooke Betts, Scott Boyd, Ramona Hoh, and Massa Shoura*. 2021. Assemblies of putative SARS-CoV2-spike-encoding mRNA sequences for vaccines BNT-162b2 and mRNA-1273. GitHub.
Dean DA, Dean BS, Muller S, Smith LC. 1999. Sequence requirements for plasmid nuclear import. Exp Cell Res 253: 713-722.
Hanna N, Heffes-Doon A, Lin X, Manzano De Mejia C, Botros B, Gurzenda E, Nayak A. 2022. Detection of Messenger RNA COVID-19 Vaccines in Human Breast Milk. JAMA Pediatr 176: 1268-1270.
Josephson F. 2020-11-19. Rapporteur’s Rolling Review assessment report. Committee for Medicinal Products for Human Use EMEA/H/C/005735/RR.
Moreau P, Hen R, Wasylyk B, Everett R, Gaub MP, Chambon P. 1981. The SV40 72 base repair repeat has a striking effect on gene expression both in SV40 and other chimeric recombinants. Nucleic acids research 9: 6047-6068.
Nance KD, Meier JL. 2021. Modifications in an Emergency: The Role of N1-Methylpseudouridine in COVID-19 Vaccines. ACS Cent Sci 7: 748-756.
Sheng-Fowler L, Lewis AM, Jr., Peden K. 2009. Issues associated with residual cell-substrate DNA in viral vaccines. Biologicals 37: 190-195.
Ulrich-Lewis JT, Draves KE, Roe K, O’Connor MA, Clark EA, Fuller DH. 2022. STING Is Required in Conventional Dendritic Cells for DNA Vaccine Induction of Type I T Helper Cell- Dependent Antibody Responses. Front Immunol 13: 861710.
Zhang L, Richards A, Barrasa MI, Hughes SH, Young RA, Jaenisch R. 2021. Reverse-transcribed SARS-CoV-2 RNA can integrate into the genome of cultured human cells and can be expressed in patient-derived tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 118.
Zheng Q, Wang T, Zhu X, Tian X, Zhong C, Chang G, Ran G, Xie Y, Zhao B, Zhu L et al. 2021. Low endotoxin E. coli strain-derived plasmids reduce rAAV vector-mediated immune responses both in vitro and in vivo. Mol Ther Methods Clin Dev 22: 293-303.

tłumaczenie:

Marek Skowroński

Naukowcy wyrażają obawy dotyczące wykrycia rakotwórczego Simian Virus 40

Dodaj komentarz