Fizyka

Szybkie obrazowanie chemiczne pojedynczych cząstek nanoplastików za pomocą mikroskopii SRS.

admin

Autorzy: Naixin Qiana, Xin Gao, Xiaoqi Lang, Xiaoqi Lang, Teodora Maria Bratu, Qixuan Chen, Phoebe Stapleton, Beizhan Yan oraz Wei Min.

źródło:

Pod redakcją: Erica O. Potmy, University of California, Irvine, CA; otrzymano 11 stycznia 2023 r.; zaakceptowano 24 października 2023 roku przez członka rady redakcyjnej Shaula Mukamela.

łumaczenie: Marek Skowroński

Problem badawczy i jego znaczenie

Mikro-nanotworzywa sztuczne pochodzące z powszechnego stosowania tworzyw sztucznych budzą coraz większe alarmujące obawy na całym świecie. Jednak nadal istnieje podstawowa luka w wiedzy na temat nanoplastików z powodu braku skutecznych technik analitycznych. W niniejszym badaniu opracowano potężną technikę obrazowania optycznego dla szybkiej analizy nanoplastików z bezprecedensową czułością i specyficznością. Jako demonstracji, mikro-nano w wodzie butelkowanej są analizowane za pomocą wielowymiarowego profilowanie poszczególnych plastikowych cząstek plastiku. Kwantyfikacja sugeruje ponad 105 cząstek w każdym litrze wody butelkowanej, z których większość to nanoplastiki. Opisane w niniejszym artykule badanie jest obietnicą wypełnienia luki w wiedzy na temat występowania w pitnej wodzie plastików na poziomie nano.

Słowa kluczowe: mikroskopia optyczna | nanoplastiki | obrazowanie ramanowskie | analiza pojedynczych cząstek | Stymulowane rozpraszanie Ramana

Streszczenie

            Tworzywa sztuczne są obecnie wszechobecne w naszym codziennym życiu. Istnienie mikroplastików (o długości od 1 µm do 5 mm), a być może nawet nanoplastików (<1 μm), wzbudziło ostatnio obawy dotyczące zdrowia. W szczególności uważa się, że nanoplastiki są bardziej toksyczne, ponieważ ich mniejszy rozmiar sprawia, że są one znacznie bardziej podatne na przedostanie się do organizmu ludzkiego w porównaniu z mikroplastikami. Jednak wykrywanie nanoplastików wiąże się z ogromnymi wyzwaniami analitycznymi zarówno w zakresie czułości na poziomie nano, jak i specyficzności identyfikacji tworzyw sztucznych, co prowadzi do luki w wiedzy na temat otaczającego nas tajemniczego nanoświata. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy hiperspektralną platformę do obrazowania ze stymulowanym rozpraszaniem Ramana (SRS) z algorytmem automatycznej identyfikacji tworzyw sztucznych, który umożliwia analizę mikro-nano-plastiku na poziomie pojedynczej cząsteczki z wysoką specyficznością chemiczną i przepustowością. Najpierw zweryfikowaliśmy zwiększenie czułości wąskiego pasma SRS, aby umożliwić szybkie wykrywanie pojedynczych nanoplastików poniżej 100 nm. Następnie opracowaliśmy algorytm dopasowania widmowego oparty na danych, aby sprostać wyzwaniom identyfikacji widmowej narzuconym przez czułe wąskopasmowe obrazowanie hiperspektralne i osiągnąć solidne oznaczenie popularnych polimerów z tworzyw sztucznych. Dzięki opracowanej technice zbadaliśmy mikro-nanoplastiki z wody butelkowanej jako system modelowy. Z powodzeniem wykryliśmy i zidentyfikowaliśmy nanoplastiki z głównych rodzajów tworzyw sztucznych. Stężenie mikro-nano tworzyw sztucznych oszacowano na około 2,4 ± 1,3 × 105 cząstek na litr wody butelkowanej, z czego około 90% to nanoplastiki. Jest to o rzędy wielkości więcej niż obfitość mikroplastiku zgłaszana wcześniej w wodzie butelkowanej (deklarowana przez producentów wód – przyp. tłumacza) Wysokowydajne zliczanie pojedynczych cząstek ujawniło niezwykłą niejednorodność cząstek i nieortogonalność między składem i morfologią tworzyw sztucznych, zaś wynikające z tego wielowymiarowe profilowanie rzuca światło na naukę o nanoplastikach.

            Przy rosnącym zużyciu plastiku każdego roku zanieczyszczenie tworzywami sztucznymi staje się coraz większym globalnym problemem (1). Zanieczyszczenia mikroplastikowe zostały zidentyfikowane niemal wszędzie w środowisku, a nawet w ludzkich próbkach biologicznych (2-4). Co więcej, coraz więcej odkryć sugeruje, że fragmentacja polimeru z tworzywa sztucznego nie zatrzymuje się na poziomie mikronów, ale raczej nadal tworzy nanoplastiki o spodziewanych ilościach wyższych o rząd wielkości (5). Dzięki zaprojektowanym cząsteczkom plastiku z fluorescencyjnymi barwnikami lub metalowymi etykietami naukowcy wykazali możliwość przekraczania przez nanoplastiki barier biologicznych i przedostawania się do układów biologicznych (6-9), budząc obawy opinii publicznej co do ich potencjalnej toksyczności (10). Pomimo chęci oceny tych obaw, przy użyciu tradycyjnych technik analiza nanoplastików pozostaje wyzwaniem. W przeciwieństwie do zaprojektowanych nanocząstek przygotowanych w laboratorium jako systemy modelowe, rzeczywiste nanoplastiki w środowisku są z natury wolne od etykiet i mają znaczną heterogeniczność, zarówno pod względem składu chemicznego, jak i morfologii cząstek (11), co może mieć odpowiednio różne konsekwencje toksyczności (12, 13). Aby wypełnić istniejącą lukę w wiedzy na temat nanoplastików w zakresie ich źródła, obfitości, losu i potencjalnej toksyczności zakodowanej w tak niejednorodnej populacji, obrazowanie pojedynczych cząstek ze specyficznością chemiczną jest niewątpliwie niezbędne, aby uniknąć utraty informacji z pomiarów zbiorczych. Jednak tradycyjne techniki obrazowania chemicznego pojedynczych cząstek, a mianowicie mikroskopia FTIR lub Ramana, są niemiarodajne z powodu stosunkowo słabej rozdzielczości instrumentalnej i czułości wykrywania (14, 15), co ogranicza ich sukces w ujawnianiu heterogeniczności tylko na poziomie mikroplastiku (16, 17). Techniki obrazowania cząstek o nanoczułości dla cząstek tworzyw sztucznych, takie jak mikroskopia elektronowa i mikroskopia sił atomowych, nie mają kluczowej specyficzności chemicznej do rozróżnienia różnych kompozycji (18, 19). Podjęto w tym kierunku szeroko zakrojone wysiłki, jednak powtarzającym się tematem w naukach analitycznych jest fakt, że większość tych technik nadal jest związana z fundamentalnym kompromisem między czułością a specyficznością (15, 20). Obrazowanie pojedynczych cząstek za pomocą spektroskopii chemicznej, niedawno zademonstrowane przez AFM-IR i STXM (21-23), ma zwykle zbyt niską przepustowość (>10 min/µm2 z widmami do identyfikacji plastiku), aby określić ilościowo środowiskowe mikro-nano-plastiki z wystarczającą statystyką cząstek. Podsumowując, czułość, specyficzność i przepustowość analizy pojedynczych cząstek są trzema kluczowymi wymaganiami do analizy nanoplastików w rzeczywistych próbkach. W niniejszym dokumencie przedstawiamy mikroskopię hiperspektralnego stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) opartą na nauce o danych jako potężnej platformie wykrywania nanoplastików w celu spełnienia tych trzech wymagań. Mikroskopia SRS wykorzystuje stymulowaną spektroskopię Ramana jako mechanizm kontrastu obrazowania i znajduje coraz większe zastosowanie w obrazowaniu biomedycznym (24-27). Podczas gdy SRS jest często uznawana za przyspieszenie zwykłego obrazowania ramanowskiego o ponad 1000 razy (26-29), co umożliwia szybką identyfikację mikroplastików (30, 31), użyteczność tej metody do analizy nanoplastików nadal pozostaje do zbadania. Aby zmaksymalizować czułość potrzebną do wykrywania pojedynczych cząstek, przyjęliśmy wąskopasmowy schemat obrazowania SRS, skupiając całą energię wiązki stymulującej na charakterystycznych modach wibracyjnych o największych przekrojach Ramana (32). Następnie wykazaliśmy, że zarówno teoretycznie, jak i eksperymentalnie, wąskopasmowe obrazowanie SRS może umożliwić wykrywanie nanoplastiku o wielkości nawet 100 nm. Jednak ograniczone cechy widmowe pochodzące tylko z najsilniejszych sygnatur wibracyjnych powyżej granicy wykrywalności stanowią wyzwanie dla automatycznej identyfikacji widma, która jest niezbędna do wysokoprzepustowej analizy cząstek tworzyw sztucznych. Aby rozwiązać ten fundamentalny kompromis między czułością a specyficznością i uwolnić pełny potencjał hiperspektralnego obrazowania SRS, opracowaliśmy algorytm dopasowania widmowego SRS oparty na bibliotece widmowej siedmiu popularnych wzorców tworzyw sztucznych. Wewnętrzna specyficzność chemiczna sygnatur wibracyjnych w kształcie spektroskopii SRS została z powodzeniem odzyskana w celu zautomatyzowanej identyfikacji polimerów do wykrywania nanoplastików za pomocą nauki o danych.

Wyposażeni w tę platformę, zbadaliśmy następnie mikro-nano-plastiki w codziennie spożywanej wodzie butelkowanej jako prototyp rzeczywistej próbki. Zidentyfikowano pojedyncze cząstki wszystkich siedmiu polimerów plastikowych z biblioteki, umożliwiając analizę statystyczną cząstek plastiku o rozmiarach od 100 do 200 nm. Ekspozycja na mikro-nano-tworzywa sztuczne została oszacowana na podstawie określonego składu polimeru. Integrując informacje morfologiczne z obrazowania, przedstawiono wielowymiarową charakterystykę poszczególnych cząstek tworzyw sztucznych, odsłaniając wszechstronną heterogeniczność cząstek tworzyw sztucznych w otaczającym nas ukrytym mikro-nano-świecie.

  1. Obrazowanie SRS nanosfer polistyrenowych z czułością pojedynczych cząstek

            Mikroskopia SRS jest dobrze znana z tego, że jest o rzędy wielkości szybsza niż zwykłe obrazowanie Ramana (25, 26). Drastycznie wyższa prędkość obrazowania mikroskopii SRS zapewnia zatem wysoką przepustowość obrazowania cząstek. Jednak to, czy szybki SRS ma lepszą granicę wykrywalności niż „zwykły Raman” i czy faktycznie może osiągnąć czułość pojedynczych cząstek nanoplastików, nie jest oczywiste. W odpowiedzi na to pytanie pomocna jest teoretyczna kwantyfikacja. Dla danego głównego typu polimeru z tworzywa sztucznego możemy oszacować masę nanoplastiku o średnicy 100 nm na podstawie gęstości tworzywa sztucznego i obliczyć liczbę powtarzających się jednostek (tj. stanowiących monomer) na podstawie jego masy cząsteczkowej. Jak pokazano w Dodatku SI, Tabela S1, liczba ta wynosi około 106 dla większości głównych rodzajów tworzyw sztucznych, na podstawie czego możemy dalej oszacować liczbę najliczniejszych wiązań chemicznych w pojedynczej cząsteczce tworzywa sztucznego na ~ 107. Możemy zatem teoretycznie wyjaśnić, dlaczego cząstka nanoplastiku o wielkości 100 nm jest trudna do wykrycia za pomocą konwencjonalnej mikroskopii ramanowskiej. Spontaniczny przekrój Ramana typowego drgania C-H wynosi około 10-29 cm2. Stąd, spontaniczny przekrój Ramana nanocząstki o wielkości 100 nm wynosi 10-22 cm2. Obszar talii lasera można zmniejszyć do około 2 × 10-9 cm2 pod obiektywem mikroskopu o wysokiej aperturze numerycznej. Prawdopodobieństwo rozpraszania Ramana na foton wzbudzający wynosi wtedy (10-22 cm2)/(2 × 10-9 cm2) = 5 × 10-14. Zakładając umiarkowanie wysoką moc lasera wynoszącą 10 mW z konwencjonalnym laserem 532 nm, co odpowiada strumieniowi wzbudzenia 3 × 1016 fotonów/s, oraz dość długi czas akwizycji wynoszący 100 ms (mały obraz 128 × 128 zajmie pół godziny), tylko około 130 fotonów może zostać wygenerowanych na cząstkę w wyniku spontanicznego rozpraszania Ramana. Biorąc pod uwagę, że wydajność kwantowa całego instrumentu (w tym obiektywu, filtrów, otworka, spektrometru i kamery) wynosi zwykle ~ 1%, ostatecznie można wykryć około 1,3 fotonu. Tak słaby sygnał może być łatwo przytłoczony szumem pochodzącym z innych źródeł, takich jak autofluorescencja. Dzięki zastosowaniu dodatkowego koherentnego lasera Stokesa, SRS wzmacnia słaby przekrój rozpraszania określonego trybu widmowego (zdefiniowanego przez różnicę energii między laserem pompującym a laserem Stokesa) poprzez stymulację kwantową. Gdy używany jest impulsowy wąskopasmowy laser Stokesa (24, 33), stymulowany współczynnik wzmocnienia Ramana może być zmaksymalizowany do ponad 108 (32, 34). Prawdopodobieństwo wystąpienia stymulowanego rozpraszania ramanowskiego na foton wzbudzenia pompy wynosi wtedy 5 × 10-6, co jest mierzone jako stymulowana strata ramanowska doświadczana przez wiązkę pompy ukierunkowaną na drgania C-H. Szum wiązki pompy przy szybkiej akwizycji mikroskopii SRS (18 µs/piksel) wynosi 5 × 10-7 (rys. 1), co jest około 10 razy niższe niż oczekiwany stymulowany sygnał strat Ramana z pojedynczej plastikowej cząstki o wielkości 100 nm. W związku z tym przewidujemy, że wąskopasmowy SRS przełamie barierę wykrywalności spontanicznego Ramana i doprowadzi do wykrycia pojedynczej nanoplastycznej cząstki w ciągu zaledwie kilkudziesięciu mikrosekund.

Ryc. 1: Obrazowanie SRS standardowych mikrosfer PS w celu scharakteryzowania czułości i rozdzielczości detekcji. (A-G) Reprezentatywne obrazy SRS (3,050 cm-1) standardowej mikrosfery PS o różnych rozmiarach: (A) 0,13 µm, (B) 0,24 µm, (C) 0,29 µm, (D) 0,46 µm, (E) 0,67 µm, (F) 1 µm i (G) 3 µm. (Pasek skali, 2 µm.) (H) Obrazy SRS nanosfery PS 0,24 µm (3,050 cm-1) o rozmiarze piksela 16 nm. (Pasek skali, 0,5 µm.) (I) Znormalizowane rozkłady intensywności wzdłuż odpowiednich linii przerywanych na rysunku (H). (J i K) Liniowa zależność logarytmu stymulowanych sygnałów strat Ramana ( , mierzonych przy 3,050 cm-1) od logarytmu wielkości cząstek w średnicy (µm). Czerwona przerywana linia pokazuje dopasowanie liniowe (R2 = 0,998) z nachyleniem 2,98. Słupki błędów, średnia ± SD. Czerwona linia ciągła wskazuje limit detekcji SRS ograniczony szumem, gdzie SNR = 1.

            Następnie eksperymentalnie weryfikujemy czułość wykrywania przy użyciu standardowych cząstek plastiku. Polistyren jest jednym z najpopularniejszych tworzyw sztucznych szeroko stosowanych w życiu codziennym. Cząstki polistyrenu o określonych rozmiarach są dostępne w handlu jako standardy analityczne i były rutynowo stosowane jako materiał modelowy do badania mikro-nanoplastików (35, 36). Widmo Ramana polistyrenu sugeruje wyraźny pik przy 3050 cm-1 pochodzący od aromatycznych drgań C-H na pierścieniu fenylowym (Dodatek SI, Rys. S1), który można selektywnie wzmocnić do obrazowania SRS poprzez dostrojenie różnicy wiązek pompy i Stokesa, aby dopasować tę energię przejścia. Używając komercyjnych mikro-nano-sfer PS o wielkości od 100 nm do 3 µm, oceniliśmy czułość detekcji naszego mikroskopu SRS w obrazowaniu nanoplastików. Aby ustabilizować cząstki podczas obrazowania, osadziliśmy rozcieńczone cząstki PS w żelu agarozowym. W miarę zmniejszania się rozmiaru cząstek, pozostałości tła wodnego wokół 3000 cm-1 zaczynają dominować (Dodatek SI, Rys. S2a), przytłaczając autentyczne widmo poszczególnych nanocząstek PS. Aby rozwiązać ten problem tła dla lepszego kontrastu obrazowania, zastąpiliśmy zwykłą H2O przez D2O w celu przygotowania żelu agarozowego (Dodatek SI, Rys. S2b). W porównaniu do H2O, widmo Ramana D2O jest przesunięte ku czerwieni do cichego regionu (2,200 do 2,800 cm-1, Dodatek SI, Rys. S3), tworząc środowisko wolne od tła do badania drgań C-H. Intensywność SRS poszczególnych cząsteczek można w ten sposób zmierzyć za pomocą jednokanałowego obrazowania wąskopasmowego o wysokiej przepustowości (~ 1000 cząsteczek w jednym polu widzenia 51 × 51 µm w ciągu 2 s, dodatek SI, rys. S4). Ta prędkość obrazowania jest o rzędy wielkości szybsza niż w przypadku innych technik obrazowania nanoplastycznego, takich jak AFM-IR i STXM (21, 23, 37). Biorąc pod uwagę limit dyfrakcji optycznej, optymalna rozdzielczość przestrzenna mikroskopii SRS wynosi 365 nm (rys. 1 H i I). Przy próbkowaniu przestrzennym o rozmiarze piksela 200 nm dla obrazowania o wysokiej przepustowości, poszczególne nanosfery PS o wielkości powyżej 500 nm można rozpoznać na podstawie ich kształtu (rys. 1 D-G). Gdy rozmiar cząstek jest mniejszy niż granica dyfrakcji (rys. 1 A-C), skończona rozdzielczość optyczna sprawia, że obraz cząstek jest ograniczony dyfrakcyjnie. Jednak intensywność SRS pojedynczej cząstki można nadal łatwo rozpoznać do 100 nm w oparciu o wzór granicy dyfrakcji i rozkład intensywności (Dodatek SI, rys. S5). Tak więc eksperymentalnie wykazaliśmy, że w porównaniu do zwykłego spontanicznego Ramana, obrazowanie SRS może oferować o rzędy wielkości wyższą szybkość/przepustowość obrazowania i lepszą granicę wykrywalności do analizy nanoplastików.

            Zaobserwowano liniową zależność między logarytmem sygnału SRS (ΔIp/Ip) a logarytmem średnicy dla cząstek PS mniejszych niż 0,7 µm (rys. 1J i dodatek SI, uwaga uzupełniająca 3). Linia trendu o nachyleniu 2,98 w tym zakresie wskazuje, że sygnał SRS (ΔIp/Ip) wzrasta liniowo wraz z objętością cząstek, która skaluje się sześciennie wraz ze wzrostem średnicy cząstek. Gdy rozmiar cząstek jest powiększany w celu przepełnienia efektywnej objętości ogniskowej sekwencyjnie w pierwszych wymiarach x, y, a następnie z (Dodatek SI, rys. S14), zależność liniowa znika. Ta dobra liniowość (R2 = 0,998) wynika z podstawowej liniowej zależności sygnału SRS od stężenia docelowego analitu, zapewniając potężne narzędzia w kilku aspektach. Po pierwsze, rzeczywisty rozmiar cząstek poniżej granicy dyfrakcji można oszacować na podstawie uzyskanej krzywej kalibracji (Dodatek SI, Rys. S16a), rozszerzając granicę charakterystyki wielkości. Po drugie, dzięki znanym informacjom o gęstości tworzywa sztucznego, ta sama krzywa kalibracji może zostać przekształcona w odniesienie do wnioskowania o masie cząstek z wykrytego obrazu nanoplastików SRS (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 3 i rys. S16b). Wreszcie, przyjmując SNR równy jeden jako próg, można określić granicę wykrywalności naszego wąskopasmowego mikroskopu SRS (rys. 1K), aby dotrzeć do nanosfer PS o wielkości do 60 nm.

2. Podstawowe wyzwania związane z identyfikacją chemiczną nanoplastików za pomocą hiperspektralnego obrazowania SRS

            Aby zapewnić wykrywalność cząstek plastiku, nanoczułość rozwiązuje kwestię pierwszego rzędu,. Spośród innych współistniejących substancji i dalszego odróżniania polimerów tworzyw sztucznych od siebie specyficzność chemiczna techniki ma również kluczowe znaczenie dla identyfikacji tworzyw sztucznych. Wykorzystując spektroskopię wibracyjną jako kontrast obrazowania, mikroskopia SRS zasadniczo posiada wymaganą specyficzność dla obrazowania chemicznego. Instrumentalnie, wykonujemy hiperspektralne obrazowanie SRS za pomocą techniki ogniskowania spektralnego (38, 39). Aby jak najlepiej pokryć charakterystyczną silną cechę plastycznego widma Ramana (Dodatek SI, Rys. S1) w zakresie strojenia przyrządu (790 do 910 nm), starannie wybraliśmy 793, 804, 886 i 897 nm jako cztery centralne długości fal, aby uwzględnić silne i charakterystyczne cechy widmowe C-H (nienasycone i nasycone węgle, 3,110 do 2,800 cm-1), wiązania estrowe (1,770 do 1,670 cm-1) i wibracje podwójnego wiązania (1,660 do 1,580 cm-1) w celu lepszego rozróżnienia każdego rodzaju tworzywa sztucznego. Skonstruowaliśmy małą bibliotekę, mierząc widma SRS siedmiu najpopularniejszych polimerów z tworzyw sztucznych (rys. 2A): poliamidu 66 (PA), polipropylenu (PP), polietylenu (PE), polimetakrylanu metylu (PMMA), polichlorku winylu (PVC), polistyrenu (PS) i politereftalanu etylenu (PET) z drobnymi odstępami spektralnymi (~ 3 cm-1).

Ryc. 2: Odzyskiwanie specyficzności chemicznej do identyfikacji polimerów za pomocą algorytmów dopasowywania widm opartych na danych SRS. (A) Znormalizowane widma SRS wzorców tworzyw sztucznych (PA, PE, PET, PMMA, PP, PS i PVC) oraz wzorca nieplastikowego (E. coli). (B i C) Przykłady widm cząstek: (B) cząstka A: PA (C) cząstka B: standardowa nanosfera PS. (D i E) Wyniki kwantyfikacji podobieństwa dla cząstek A i B z konwencjonalnych algorytmów dopasowywania widm: (D) współczynniki korelacji Pearsona i (E) kwadratowy cosinus euklidesowy (SEC). Czerwona przerywana linia wskazuje warunek progowy z 95% wskaźnikiem identyfikacji ze standardowych nanosfer PS. Ten sam warunek progowy powoduje nieuchwytną identyfikację cząsteczki A. (F) Proces uczenia jest wskazywany przez wykres rozrzutu ln(SMCSRS) względem intensywności SRS α uzyskanej z równania 1. Ciągłe punkty danych pochodzą z syntetycznego zbioru danych opartego na standardach. Niebieskie okrągłe punkty danych to dane eksperymentalne z hiperspektralnego obrazowania SRS nanosfer PS o trzech różnych rozmiarach, które dobrze kolokalizują z punktami z syntetycznego widma PS (jasnoniebieski) z dobrym oddzieleniem od danych syntetycznych z innych składów chemicznych (stałe punkty danych w innych kolorach). Czerwona linia ciągła wskazuje linię progową narysowaną dla identyfikacji polimeru z tworzywa sztucznego. (G) Macierz pomyłek do oceny warunków progowych na podstawie eksperymentalnych pomiarów cząstek tworzyw sztucznych (H-N). Wyniki identyfikacji polimeru przykładowej cząstki A i cząstki B przy użyciu algorytmów dopasowania widmowego opartych na danych SRS. Na każdym obrazie (H-N) czarna linia to próg określony w procesie uczenia. Jasnoniebieski okrąg ze standardowej cząstki PS B jest idealnie potwierdzony tylko za pomocą schematu dopasowania PS o wartości SMCSRS poniżej linii progowej (rys. 2M). Czerwony okrąg z nieznanej cząstki A jest jednoznacznie identyfikowany jako PA, tylko w przypadku schematu dopasowania PA z wartością SMCSRS poniżej linii progowej (rys. 2H).

            W przeciwieństwie do pomiaru widm masowych, obrazowanie pojedynczych cząstek nanoplastików wymaga znacznie mniejszego rozmiaru piksela, dłuższego czasu integracji i wyższej mocy dla optymalnego stosunku sygnału do szumu. W związku z tym, ze względu na fundamentalny kompromis między czułością wykrywania a specyficznością, pomiar nanoplastików z tak małymi interwałami spektralnymi jest prawie niemożliwy (godziny czasu obrazowania na FOV z rosnącym prawdopodobieństwem dryfowania i spalania próbki w tym czasie). Co więcej, rozdzielczość spektralna hiperspektralnego mikroskopu SRS opartego na ogniskowaniu spektralnym wynosi zazwyczaj od 10 do 25 cm-1. Aby uzyskać wydajne obrazowanie hiperspektralne z odpowiednią równowagą między przepustowością a rozdzielczością spektralną, dodatkowo podpróbkowaliśmy widma (Dodatek SI, Rys. S6) z interwałem spektralnym ~ 15 cm-1, który jest tylko nieznacznie powyżej rozdzielczości spektralnej i daje akceptowalną przepustowość obrazowania (~ 0,5 h na 0,2 mm × 0,2 mm FOV) dla jednocząsteczkowego obrazowania chemicznego nanoplastików. Wysokowydajna analiza cząstek tworzyw sztucznych wymaga również zautomatyzowanej analizy spektralnej do identyfikacji tworzyw sztucznych. Algorytmy dopasowywania widm do automatycznej identyfikacji chemicznej są powszechnie stosowane w analizie mikroplastików w oparciu o spektroskopię FTIR lub Ramana (40, 41). Przy tysiącach widm cząstek wymagających analizy w typowym badaniu środowiskowym, ręczna identyfikacja i liczenie tworzyw sztucznych jest nie tylko niemożliwie pracochłonne, ale także narażone na ludzką stronniczość (14, 40-42). Zautomatyzowana analiza cząstek pomaga przyspieszyć pomiar, przeanalizować więcej cząstek, a także zapewnić wszechobecną i bezstronną identyfikację tworzyw sztucznych. Rozumiejąc potrzebę automatyzacji w naukach o środowisku, zaczęliśmy od zastosowania klasycznych algorytmów dopasowywania bibliotek w analizie FTIR i Ramana, ale okazało się, że nie są one tak kompatybilne z wąskopasmową analizą hiperspektralną SRS. Weźmy jako przykład wykryte widmo cząsteczki A przygotowane z mielenia wzorca PA (Rys. 2B). Po wstępnym przetworzeniu widma w celu odjęcia tła i normalizacji danych, widmo cząstki A wyraźnie pasuje do sygnatury SRS poliamidu. Jednak podczas pomiaru podobieństwa widmowego cząstki A do wzorców tworzyw sztucznych z biblioteki przy użyciu popularnych algorytmów dopasowania widmowego (42), takich jak współczynnik korelacji Pearsona (PC) lub kwadratowy cosinus euklidesowy (SEC), wyniki identyfikacji wydają się nieuchwytne (rys. 2 D i E). W rzeczywistej analizie próbki nie powinno być przesłanek, aby zakładać, że cząstka A powinna należeć do jakiegokolwiek standardowego tworzywa sztucznego w bibliotece, co oznacza, że ocena „tak” lub „nie” musi być dokonywana niezależnie dla każdego standardu tworzywa sztucznego w oparciu o dany próg. Powszechnym progiem stosowanym w analizie FTIR lub spontanicznej analizie ramanowskiej mikroplastików jest pomiar podobieństwa powyżej 0,7, co jest wyraźnie zbyt niskie, aby zidentyfikować cząstkę A. Ponieważ nanocząstki PS są dostępne jako wzorce modelowe, najpierw próbujemy zbadać próg podobieństwa każdego algorytmu do analizy nanoplastików w hiperspektralnym obrazowaniu SRS. Próg podobieństwa można następnie określić na podstawie kwartyla identyfikacji co najmniej 95% cząstek PS (wskaźnik podobieństwa powyżej 0,75 dla PC i wskaźnik podobieństwa powyżej 0,94 dla SEC). Jednak w przypadku cząstki A trudna część oceny identyfikacji binarnej pozostaje, ponieważ pomiary podobieństwa z trzech polimerów z tworzyw sztucznych (PA, PP i PVC) są bardzo zbliżone pod względem liczby i wszystkie przekraczają próg (rys. 2 D i E). Należy zauważyć, że nie można po prostu wybrać najlepszego wyniku spośród wszystkich standardów, ponieważ jest całkowicie możliwe, aby A był materiałem nieplastycznym w rzeczywistej analizie próbki. W rzeczywistości, jeśli zasymulujemy możliwe nieplastyczne widma SRS w oparciu o modelowe standardowe widmo biomasy reprezentowane przez E. coli, ponad 95% z nich będzie miało pomiary podobieństwa do standardu PA powyżej danego progu dla obu algorytmów (Dodatek SI, rys. S12 a i b).

Uważamy, że główna przyczyna powyższych trudności wynika z kompromisu między czułością wykrywania a specyficznością. Podkreślając specyficzność chemiczną, spontaniczna spektroskopia Ramana lub inna szerokopasmowa spójna mikroskopia Ramana może obejmować rozszerzone okno spektralne (> 1000 cm-1) poprzez dystrybucję mocy optycznej wśród dużej liczby modów wibracyjnych Ramana. Bogata informacja spektralna może umożliwić identyfikację chemiczną za pomocą prostych algorytmów, ale wiąże się z kosztem ponad tysiąckrotnie obniżonej czułości wykrywania przy ograniczonym czasie przebywania piksela (43-45). Jednakże, w kontekście analizy nanoplastików, wykrywanie sygnału cząsteczkowego jest warunkiem wstępnym przed identyfikacją chemiczną na podstawie widma wibracyjnego. Mając na celu pomiar jak najmniejszych cząstek plastiku przy praktycznej przepustowości, ostatecznie tylko najsilniejsze cechy Ramana będą wykrywalne przy rozsądnym SNR. W przypadku większości tworzyw sztucznych, które z natury są polimerami organicznymi, najsilniejsze sygnatury Ramana znajdują się w ograniczonym oknie drgań C-H. W tym przypadku specyficzna identyfikacja chemiczna wymaga od algorytmów precyzyjnego uchwycenia cech kształtu w ograniczonym oknie spektralnym, co wykracza poza możliwości konwencjonalnych algorytmów dopasowania spektralnego. Co więcej, nieuchronnie zagrożony i ograniczony stosunek sygnału do szumu podczas obrazowania małych nanocząstek stwarza dalsze wyzwania w interpretacji spektralnej w celu solidnej identyfikacji chemicznej. Dlatego potrzebne są nowe metody, aby sprostać wyzwaniu specyficzności narzuconemu przez oprzyrządowanie SRS, które umożliwia bezprecedensową czułość w obrazowaniu nanoplastików.

3. Algorytm dopasowania spektralnego SRS dostosowany do danych odzyskuje specyficzność chemiczną

Wykorzystując naukę o danych, dążymy do opracowania algorytmów interpretujących kształt wykrytych cech SRS i odzyskujących specyficzność chemiczną do identyfikacji polimerów. Po pierwsze, współczynnik dopasowania widmowego dostosowany do SRS (SMCSRS) został opracowany jako wskaźnik do ilościowego określenia podobieństwa widmowego przy zminimalizowanych zakłóceniach szumowych (rys. 2, rów. 1). SMCSRS wykorzystuje algorytm optymalizacji, który uwzględnia wykryte widmo SRS pochodzące ze skalowania (współczynnik intensywności) znormalizowanego standardowego widma plus pewien wkład tła w warunkach obrazowania ( , < 1). Dopasowane widmo ( ) zostało porównane z wykrytym widmem cząstek w celu znalezienia minimalnej możliwej odległości widmowej jako SMCSRS. Mniejsza wartość SMCSRS wskazuje na większe podobieństwo widmowe do odpowiednich wzorców. Wskaźnik SMCSRS zapewnia kilka korzyści w celu wykrywania nanoplastików. Algorytm optymalizacji uwzględnia wszystkie punkty spektralne jednocześnie, co zmniejsza bezpośredni wpływ szumu na każdy konkretny punkt spektralny. Proces dopasowania wykorzystuje wiarygodność pomiaru podobieństwa. Ponadto, wynik pomiaru jest interpretowalny. Dobrze zdefiniowany współczynnik intensywności α i współczynnik tła β mogą wskazywać wkład każdego składnika widmowego (cząstki i otaczającego tła). Wreszcie, pomiar odległości widmowej zapewnia metryczną ocenę podobieństwa.

Dzięki ilościowemu określeniu podobieństwa widmowego w ten wyrafinowany sposób, powróciliśmy do wyzwania polegającego na dokonaniu niearbitralnej oceny binarnej w celu identyfikacji polimeru. Planowaliśmy opracować metodę opartą na uczeniu się, aby określić wcześniej nieuchwytny próg binarny do identyfikacji wszystkich polimerów z tworzyw sztucznych. Nasze założenie jest takie, że jeśli możemy zmierzyć widma nanocząstek dla wszystkich rodzajów tworzyw sztucznych w bibliotece, będziemy w stanie uczyć się na podstawie danych i wyznaczyć prawidłową granicę identyfikacji w oparciu o rozkład cząstek o znanej tożsamości. W rzeczywistości jednak komercyjnie dostępne są tylko nanosfery PS o dobrze scharakteryzowanym składzie chemicznym i rozmiarach nano. Bez wiarygodnej prawdy pochodzącej z innych nanocząstek polimerowych, musimy szukać alternatywnych sposobów gromadzenia ogromnej ilości informacji potrzebnych do rygorystycznego określenia progu. Zainspirowani rosnącą użytecznością danych syntetycznych w sztucznej inteligencji (46) i rosnącym zaangażowaniem nauki o danych w mikroskopii SRS (47-49), zdaliśmy sobie sprawę, że możemy symulować eksperymentalne widma SRS nanoplastików z masowych widm standardowych, aby służyć jako treningowy zbiór danych (tj. dane syntetyczne). Opierając się na naszym zrozumieniu oprzyrządowania SRS, zaproponowaliśmy model, w którym istnieją dwa główne źródła szumu w typowym hiperspektralnym widmie SRS: jednym z nich jest podstawowy szum na intensywności SRS, jak w scenariuszu ograniczonego szumu, który można łatwo odczytać z tego samego obrazu SRS; drugim jest niepewność częstotliwości narzucona przez oprzyrządowanie SRS, w którym zarówno profil lasera, jak i ruchomy stopień opóźnienia mogą powodować fluktuacje rzeczywistej częstotliwości wzbudzonej w każdym pomiarze wokół zadanych punktów widmowych. Zakładając, że fluktuacje mają rozkład gaussowski, wykorzystaliśmy nanosfery PS jako model standardowy do zbadania zakresu fluktuacji i stwierdziliśmy imponującą spójność obliczeń SMCSRS z widm syntetycznych i zmierzonych widm nanocząstek PS (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 2 i rys. S10). Kombinatoryczny charakter pochodzenia szumów wyjaśnia zależność wartości SMCSRS od intensywności widma ( ), jak zasugerowano w symulacji i potwierdzono w eksperymencie (Rys. 2F). Stosując ten sam model dla wszystkich wzorców w bibliotece, wygenerowaliśmy syntetyczny zestaw danych zawierający możliwe widma SRS dla nanoplastików każdego polimeru w bibliotece tworzyw sztucznych. Ładna separacja wartości SMCSRS pojawia się pomiędzy widmami cząsteczki ( , R jest prawidłową tożsamością standardowego polimeru) i widmami cząsteczki ( ) na wszystkich wykresach rozrzutu (Dodatek SI, Rys. S11). Przy masowo generowanych syntetycznych punktach danych, funkcja logarytmiczna została dopasowana zgodnie z trendem rozproszonych punktów jako linia progowa dla identyfikacji polimeru (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 2 i Tabela S2).

Najpierw oceniamy wydajność identyfikacji, symulując inny syntetyczny zestaw danych ze wszystkich standardów w bibliotece jako dane testowe. W porównaniu z konwencjonalnymi algorytmami dopasowywania widm, opracowany SRS wykazuje minimalną liczbę wyników fałszywie dodatnich w identyfikacji tworzyw sztucznych (Dodatek SI, Rys. S12). Nie więcej niż 0,5% widm nieplastycznych (symulowanych z E. coli) jest błędnie identyfikowanych jako trafienie dla dowolnego typu plastiku w bibliotece (Dodatek SI, Rys. S12c), co stanowi drastyczną poprawę w porównaniu z ponad 97% przy użyciu konwencjonalnych algorytmów dopasowywania widm (Dodatek SI, Rys. S12 a i b). Fałszywie dodatnie wyniki między polimerami o podobnym widmie SRS są również znacznie zmniejszone, a maksimum wynosi około 5% PA błędnie zidentyfikowanych jako PP (Dodatek SI, rys. S12c). Ta sama liczba wynosi ponad 97%, jeśli PC lub SEC są używane jako miary podobieństwa z określonymi progami (Dodatek SI, rys. S12 a i b). Aby dodatkowo zająć się możliwymi rzadkimi przypadkami, w których cząsteczka jest identyfikowana jako trafienia dla więcej niż jednego polimeru w bibliotece, tożsamość chemiczna odpowiedniej cząsteczki zostanie przypisana do polimeru o najmniejszej wartości SMCSRS. Dzięki ustalonemu przepływowi pracy identyfikacji spektralnej można osiągnąć ponad 96% wskaźnik identyfikacji przy fałszywie dodatnim wskaźniku poniżej 1% dla wszystkich polimerów w bibliotece (Dodatek SI, ryc. S12d). Ponieważ nanosfera PS była jedynym dostępnym wzorcem nanoplastiku, eksperymentalna walidacja przepływu pracy opiera się na obrazowaniu odpowiednich mikroplastików przygotowanych z mielenia wzorców polimerów za pomocą krio-młyna. Mając nadzieję na jak najlepsze naśladowanie podobnego poziomu zmienności widmowej, warunki obrazowania zostały odpowiednio dostosowane, aby dopasować stosunek sygnału do szumu pomiaru nanoplastiku. Ostatecznie potwierdziliśmy ten sam wskaźnik identyfikacji wynoszący ponad 96% w eksperymentalnym pomiarze cząstek, bez obserwowanych cząstek plastiku błędnie zidentyfikowanych jako inne polimery w bibliotece (rys. 2G). Opracowanie tego algorytmu opartego na danych pozwala na identyfikację każdego plastikowego polimeru z wyraźnymi cechami wibracyjnymi w ograniczonym oknie spektralnym, uzyskując w ten sposób wymaganą specyficzność chemiczną do automatycznej identyfikacji spektralnej. Powracając do identyfikacji cząsteczki A i standardowej nanosfery PS B, możemy poprawnie zidentyfikować zarówno cząsteczkę A, jak i cząsteczkę B w całej bibliotece jako PA i PS (rys. 2 H-N), przy czym SMCSRS dobrze wychwytuje różnice kształtu pominięte przez konwencjonalne algorytmy i próg wyciągnięty z badania opartego na danych. Łącząc sposób myślenia nauki o danych z zaawansowaną nauką o pomiarach, w końcu przezwyciężyliśmy fundamentalny kompromis między czułością a specyficznością dla wysokowydajnej hiperspektralnej analizy SRS. Doskonała nanoczułość dzięki wąskopasmowemu wzmocnieniu SRS i specyficzność chemiczna z solidną identyfikacją chemiczną są jednocześnie osiągane, aby wypełnić brakującą lukę w narzędziach do analizy nanoplastików.

4. Opracowanie przepływu pracy do wykrywania mikro-nano-plastiku z wody butelkowanej

Po ustanowieniu platformy, przeszliśmy do zastosowania narzędzia do badania mikro-nano-plastiku z rzeczywistych próbek. Mikroplastiki zostały powszechnie znalezione w żywności dla ludzi (50), napojach (51) i opakowaniach produktów (52-55), wśród których woda butelkowana jest szczególnie interesująca, ponieważ jest ważnym źródłem mikroplastików do spożycia w życiu codziennym (56-59). Ograniczona przez kompromis czułość-specyficzność w naukach analitycznych (Dodatek SI, Rys. S18b), wiedza literaturowa ogranicza się do mikroplastików w wodzie butelkowanej (Dodatek SI, Tabela S4) (19, 60-62), pozostawiając nanoplastiki w większości niezbadane. Do tej pory opisano jedynie zbiorcze charakterystyki wykorzystujące kombinacje technik do analizy podwielokrotności stężonych nanocząstek z wody butelkowanej. Potrzebne są informacje dotyczące wewnętrznej heterogeniczności zanieczyszczenia nanoplastikami na poziomie pojedynczych cząstek (Dodatek SI, Rys. S18a) (63, 64). Poniżej przedstawiamy zwięzły proces kompleksowej charakterystyki mikro-nano tworzyw sztucznych, możliwy dzięki szybkiemu obrazowaniu chemicznemu pojedynczych cząstek z nanoczułością za pomocą mikroskopii SRS. Bogate informacje można uzyskać z pojedynczego pomiaru, aby uzyskać jednoczesną charakterystykę składu chemicznego i morfologii, umożliwiając wielowymiarową statystykę poprzez wysokowydajną analizę pojedynczych cząstek.

            Filtracja jest jedną z najczęstszych metod zbierania cząstek powyżej określonych rozmiarów na powierzchni membrany. Byłoby wysoce preferowane do analizy rzeczywistych próbek, gdyby zebrana membrana była bezpośrednio kompatybilna z obrazowaniem SRS. Membrany z tlenku glinu mają minimalne tło w docelowym oknie spektralnym i wykazały dobrą kompatybilność ze spektroskopią wibracyjną. Pozornie nieprzezroczysta membrana z tlenku glinu może być łatwo przekształcona w przezroczyste okno obrazowania poprzez zastosowanie ciężkiej wody w celu zmniejszenia niedopasowania współczynnika załamania światła. Zaowocowało to transmisyjnym obrazowaniem SRS z akceptowalną retencją sygnału (~70% pierwotnej czułości, Dodatek SI, Rys. S7 b i c). Osadzenie cząstek na powierzchni membrany in situ za pomocą żelu agarozowego przygotowanego z D2O dodatkowo umożliwiło stacjonarne obrazowanie SRS pojedynczych cząstek przy minimalnym tle obrazowania. W ten sposób zwięzłe wstępne przetwarzanie próbki wystarcza do wysokiej jakości obrazowania SRS oryginalnej membrany filtracyjnej (Dodatek SI, ryc. S7a), unikając niepożądanej utraty próbki lub zanieczyszczenia w skomplikowanych procesach suszenia lub przenoszenia próbki. Ustalony przepływ pracy do analizy narażenia na mikro-nano-tworzywa sztuczne z wody butelkowanej za pomocą hiperspektralnego obrazowania SRS przedstawiono na rys. 3. Dla każdej próbki losowo wybrano pięć lub więcej pól widzenia (FOV) w obszarze zbierania do obrazowania hiperspektralnego pod mikroskopem SRS (rys. 3D). W każdym FOV mikro-nano-plastiki były wykrywane przez zintegrowany proces analizy danych, który automatycznie przeprowadzał segmentację cząstek i identyfikację tworzyw sztucznych za pomocą opracowanych algorytmów i zweryfikowanych warunków progowych. Informacje morfologiczne i chemiczne każdej pojedynczej cząstki plastiku uzyskane z hiperspektralnych obrazów SRS zostały następnie połączone w celu zapewnienia wielowymiarowego profilowania (ryc. 3E). Postępując zgodnie z procedurą, przeanalizowaliśmy wodę butelkowaną trzech różnych marek zakupioną w tym samym czasie od dużego sprzedawcy detalicznego. Ze względu na brak dostępu do wody wolnej od plastiku w laboratorium (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 6), filtry Anodisc zostały przygotowane i zmierzone w taki sam sposób, jak ślepa próba kontrolna. W wynikach byliśmy w stanie jednoznacznie wykryć pojedyncze cząstki dla wszystkich siedmiu polimerów z tworzyw sztucznych w bibliotece poprzez dopasowanie widmowe do odpowiadających im wzorców masowych (ryc. 4), demonstrując potężną zdolność identyfikacji tworzyw sztucznych naszej hiperspektralnej platformy obrazowania SRS opartej na danych.

Ryc. 3: Wykrywanie mikro-nano tworzyw sztucznych w wodzie butelkowanej: przygotowanie próbki, obrazowanie SRS i analiza danych. (A) Schemat zestawu filtracyjnego do zbierania mikro-nanocząstek plastiku z wody butelkowanej. Cząstki z dwóch butelek z próbkami wody są koncentrowane na okrągłym obszarze (d = 13 mm) w środku membrany zgodnie z procedurą opisaną w informacjach uzupełniających. (B) Schemat przekładania membran w celu przygotowania próbek przezroczystych membran do obrazowania SRS. Uzyskana próbka (rys. 3C) jest następnie montowana na mikroskopie (rys. 3D) w celu obrazowania hiperspektralnego SRS. (C) Uzyskana próbka przezroczystej membrany nałożona na obraz fluorescencyjny standardowych fluorescencyjnych cząstek PS zebranych na membranie ilustruje równomierny rozkład cząstek na okrągłej powierzchni w środku membrany (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 5). (D) Schemat mikroskopu SRS. (E) Schemat automatycznej identyfikacji cząstek plastiku. Wstępnie przetworzone stosy hiperspektralnych obrazów SRS są analizowane przez skrypt MATLAB w celu automatycznej identyfikacji cząstek plastiku. Dla każdego obrazu rezonansowego dla docelowego polimeru z tworzywa sztucznego, wykryte cząstki są segmentowane jako obszary zainteresowania (ROI) w celu wyodrębnienia informacji chemicznych i morfologicznych do analizy. Widmo SRS jest ekstrahowane w każdej cząstce/ROI poprzez pomiar intensywności na stosie obrazów hiperspektralnych. W przypadku cząstek z pikami SRS w odpowiednim oknie spektralnym, podobieństwo spektralne do docelowego wzorca tworzywa sztucznego jest określane ilościowo poprzez obliczenie SMCSRS z warunkiem progowym zastosowanym do oceny identyfikacji tworzywa sztucznego. Informacje morfologiczne, takie jak rozmiar i kształt, są wyodrębniane w trakcie analizy obrazu, a następnie tworzone są obrazy statystyczne złożone z każdej zidentyfikowanej pojedynczej cząstki plastiku.

Ryc. 4: Pojedyncze mikro-nano-plastiki zidentyfikowane dla każdego docelowego polimeru z wody butelkowanej. (A-G) Reprezentatywne obrazy SRS drobnych cząstek plastiku wykrytych dla każdego polimeru: (A) poliamid, (B) polipropylen, (C) polietylen, (D) polimetakrylan metylu, (E) polichlorek winylu, (F) polistyren i (G) politereftalan etylenu. (Pasek skali, 0,6 µm.) Większość z tych cząstek ma wielkość poniżej 1 µm. (H-N) Odpowiednie widma SRS wykrytych cząstek plastiku. Niebieskie linie to widma wykrytych cząstek. Pomarańczowe linie to dopasowane widma z plastikowych wzorców.

5. Wielowymiarowe profilowanie mikro-nano-plastiku w wodzie butelkowanej

            Kwantyfikacja z obrazów pojedynczych cząstek ze zidentyfikowanym składem polimeru z tworzywa sztucznego dostarcza wielowymiarowych informacji w celu zbudowania analitycznej panoramy niezbadanych nanoplastików w wodzie butelkowanej. Ilościowa kwantyfikacja poprzez zliczanie cząstek sugeruje, że średnio od 78 do 103 cząstek plastiku zostało zidentyfikowanych w każdym FOV (0,2 mm × 0,2 mm) dla trzech różnych marek, co było znacznie wyższe (P < 0,001) niż w przypadku próbek ślepych (ryc. 5A). Zakładając równomierny rozkład cząstek mikro-nano plastiku na powierzchni obszaru membrany (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 5), możemy oszacować ekspozycję na mikro-nano plastik z wody butelkowanej. Szacujemy, że na każdy litr wody butelkowanej różnych marek przypada średnio około 2,4 ± 1,3 105 cząstek plastiku (ryc. 5C). Poszczególne cząstki każdego rodzaju polimeru są analizowane oddzielnie w celu ujawnienia niejednorodności chemicznej. W bibliotece stwierdzono, że PA, PP, PET, PVC i PS prawdopodobnie odgrywają znaczącą rolę w narażeniu na mikro-nanoplastiki z wody butelkowanej (rys. 5B). Dokładny skład chemiczny mikro-nano tworzyw sztucznych różnił się w zależności od marki, ale PA wydaje się być wspólnym głównym czynnikiem przyczyniającym się do ich ilości we wszystkich trzech analizowanych przez nas markach.

Ryc. 5. Kwantyfikacja ekspozycji na mikro-nano plastik z wody butelkowanej. (A) Uśredniona liczba wykrytych cząstek plastiku na pole widzenia. Słupki błędów, średnia ± SEM. (B) Uśredniona liczba cząstek dla każdego wykrytego polimeru plastiku na pole widzenia. Słupki błędów, średnia ± SEM. Statystycznie istotne różnice określono za pomocą uogólnionej analizy liniowego modelu mieszanego z poprawką Bonferroniego. *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001. (C) Liczba cząstek plastiku oszacowana w 1 l wody butelkowanej. Słupki błędów, średnia ± SEM. (D) Proporcja liczbowa każdego plastikowego polimeru zmierzona w każdej marce wody butelkowanej. (E) Masa cząstek plastiku oszacowana na podstawie intensywności SRS w 1 l wody butelkowanej. Słupki błędów, średnia ± SEM. (F) Udział masowy każdego plastikowego polimeru zmierzony w każdej marce wody butelkowanej.

            Wykorzystując liniową zależność między intensywnością SRS a ilością analitów w objętości ogniskowej, jesteśmy również w stanie oszacować ekspozycję w masie oprócz liczby cząstek. Krzywą kalibracji masy można oszacować dla każdego polimeru na podstawie gęstości i względnej intensywności SRS z liniowej zależności uzyskanej przez standardowe nanosfery PS (Dodatek SI, rys. S16). Zintegrowana intensywność w obszarze zainteresowania dla każdej cząstki jest zatem konwertowana na masę (Rys. 5 E i F). Szacowana ekspozycja na mikro-nanoplastik w masie jest obliczana na poziomie około 10 ng/L. Analizując skład chemiczny w masie, znajdujemy niezauważalne różnice między wkładem ilościowym według masy a wkładem według liczby. Weźmy jako przykład wyniki dla marki C. Nanoplastiki PS, choć dominują pod względem liczby cząstek, stanowią jedynie niewielką część masy. Zamiast tego PET staje się głównym czynnikiem przyczyniającym się do wzrostu masy. Taka pozorna rozbieżność podkreśla potencjalne niezrozumienie składu tworzywa sztucznego na podstawie zbiorczej charakterystyki cząstek, które wynika z heterogenicznej natury mikro-nano tworzyw sztucznych z rzeczywistych próbek. Charakterystyka morfologiczna poszczególnych cząstek możliwa dzięki mikroskopii SRS bezpośrednio ujawnia inny wymiar niejednorodności cząstek. Przedstawiono analizę statystyczną wielkości i kształtu cząstek na podstawie obrazów pojedynczych mikro-nanocząstek o dobrze zdefiniowanej tożsamości. Podczas pomiaru rozkładu wielkości jesteśmy w stanie scharakteryzować cząstki poniżej granicy dyfrakcji poprzez ekstrapolację wielkości z odczytu intensywności (zakładając, że cząstki są stałymi kulami) i wykorzystując liniową zależność między objętością cząstek a sygnałem SRS jako kalibrację (Dodatek SI, Uwaga uzupełniająca 3). W rezultacie okazało się, że cząstki tworzyw sztucznych o różnym składzie chemicznym mają w rzeczywistości różne wzorce rozkładu wielkości (rys. 6 A-G). Bezpośrednia obserwacja niejednorodności cząstek zapewnia naturalne wyjaśnienie różnic w składzie chemicznym obserwowanych na podstawie pomiaru masy lub liczby. Weźmy jako przykład PS i PET: rozkład wielkości cząstek PS koncentruje się wokół 100 do 200 nm, podczas gdy cząstki PET mają zwykle rozkład wielkości zbliżony do 1 do 2 mikronów, co wyjaśnia, dlaczego PET jest bardziej znaczącym składnikiem przy pomiarze masy, podczas gdy PS wyraźnie dominuje przy liczeniu liczby cząstek (rys. 5 D i F).

Ryc. 6. Profile statystyczne wielkości i kształtu cząstek dla każdego plastikowego polimeru znalezionego w wodzie butelkowanej. (A-G) Rozkład wielkości wykrytych cząstek dla każdego polimeru plastiku: (A) poliamid, (B) polipropylen, (C) polietylen, (D) polimetakrylan metylu, (E) polichlorek winylu, (F) polistyren i (G) politereftalan etylenu. Obszar zacieniony na czerwono oznacza mikrodrobiny plastiku. Obszar zacieniony na zielono wskazuje cząstki o rozmiarach poniżej rozdzielczości optycznej mikroskopii SRS, które są wykrywane we wzorze ograniczenia dyfrakcji. W przypadku cząstek o rozmiarze powyżej granicy dyfrakcji rozmiar cząstek jest mierzony za pomocą minimalnej średnicy Fereta. W przypadku cząstek wykrytych jako wzory ograniczone dyfrakcją, rzeczywisty rozmiar cząstek jest szacowany na podstawie intensywności SRS, wykorzystując liniową zależność między intensywnością SRS a objętością nanocząstek, przy założeniu, że nanoplastiki istnieją jako stała kula. (H) Rozkład kształtu wykrytych cząstek dla każdego plastikowego polimeru mierzony współczynnikiem kształtu. (I-M) Reprezentatywne obrazy SRS cząstek plastiku o różnych kształtach wskazanych przez różne współczynniki kształtu. Dodatek SI, Rys. S9 pokazuje odpowiednie widma SRS. (Pasek skali, 0,6 µm.)

            Kształt jest kolejną ważną cechą morfologiczną, która ma znaczenie jako krytyczny aspekt nanotoksyczności. Badania wykazały, że kształt odgrywa rolę w określaniu absorpcji komórkowej mikro-nanocząstek (65, 66). Obrazy SRS cząstek plastiku potwierdziły istnienie różnorodności kształtów mikro-nanocząstek plastiku w wodzie butelkowanej. Aby uwzględnić kształt cząstek plastiku w sposób statystyczny, zmierzyliśmy współczynnik kształtu poszczególnych cząstek powyżej granicy dyfrakcji (rys. 6H). Współczynnik kształtu jest powszechnie uznawany w badaniach nanotoksykologicznych (67, 68). Współczynnik kształtu wykrytych cząstek plastiku waha się od 1 do 6, a średni współczynnik kształtu cząstek wynosi około 1,7. Rys. 6 I-M przedstawia obrazowo, w jaki sposób współczynnik kształtu jest powiązany z kształtem cząstek. Cząstki o współczynniku kształtu powyżej 3 najprawdopodobniej będą miały kształt włóknisty, podczas gdy cząstki o współczynniku kształtu poniżej 1,4 będą w dużej mierze kuliste. Zmienność kształtu cząstek tworzyw sztucznych stwierdzono we wszystkich wykrytych polimerach, potwierdzając powszechnie uznaną ideę, że rzeczywiste mikro-nano-tworzywa sztuczne mają zróżnicowane morfologiczne dobrobyt. Wymiar ten jest trudny do podobieństwa do zaprojektowanych nanocząstek polimerowych powszechnie badanych w laboratoriach badawczych, a konsekwencje toksykologiczne związane z narażeniem na rzeczywiste cząstki tworzyw sztucznych i ich różne właściwości fizykochemiczne (tj. rozmiar, kształt) nie zostały jeszcze określone.

6. Dyskusje i wnioski

            Opracowując opartą na danych hiperspektralną platformę obrazowania SRS do analizy mikro-nano-plastików, opisaliśmy metodologię poprawy czułości wykrywania nanocząstek i specyficzności identyfikacji polimerów, co pozwoliło nam zacząć zajmować się długotrwałą luką w wiedzy na temat nanoplastików. Szacujemy, że narażenie na mikro-nanoplastiki ze zwykłej wody butelkowanej było na poziomie 105 cząstek na litr, co stanowi dwa do trzech rzędów wielkości więcej niż wcześniej zgłoszone wyniki skupiające się jedynie na dużych mikroplastikach (Dodatek SI, Tabela S4) (58, 59, 61, 69, 70). Jeśli chodzi o oszacowanie narażenia ludzi, wartości te są znacznie wyższe niż te obecnie zgłaszane w literaturze (56, 71), co wynika z nowo wykrytej nanoplastycznej frakcji cząstek plastiku. Maleńkie cząstki, które wcześniej były niewidoczne w konwencjonalnym obrazowaniu, w rzeczywistości dominują pod względem liczby i stanowią około 90% całej populacji wykrytych cząstek plastiku. Pozostałe 10% zidentyfikowane jako mikroplastik ma stężenie około 3 × 104 cząstek na litr (Dodatek SI, rys. S17), przy czym większość z nich ma rozmiar poniżej 2 µm. Większe cząstki (>2 µm), które są łatwiejsze do zidentyfikowania pod zwykłym mikroskopem optycznym, są tego samego rzędu wielkości, co zgłoszona analiza mikroplastiku, w zależności od ograniczonego wykrywania zgłoszonego w oparciu o różne technologie (Dodatek SI, rys. S17 i tabela S4). Nasze wyniki potwierdzają fragmentację tworzyw sztucznych poza poziom mikronów poprzez jednoznaczne wykrywanie nanoplastików w rzeczywistych próbkach. Podobnie jak w przypadku wielu innych rozkładów wielkości cząstek w świecie przyrody, istnieje znacznie więcej nanoplastików, mimo że są one niewidoczne lub niezidentyfikowane w konwencjonalnych technikach obrazowania cząstek, niż poprzednio liczone duże mikrony. Tę populację nanoplastików można również łatwo przeoczyć w kwantyfikacji masowej, ponieważ nanocząstki o mniejszych rozmiarach zawierają substancje pozbawione kształtu sześciennego. Jednak biorąc pod uwagę zdolność tych nanoplastycznych cząstek do przekraczania bariery biologicznej, nanocząstki, pomimo pozornie trywialnego wkładu w pomiar masy, mogą odgrywać dominującą rolę w ocenie toksyczności (72, 73).

Stwierdziliśmy również, że wiele wykrytych cząstek ma widma SRS, które nie pasują do żadnego ze standardów. W rzeczywistości nasza mała biblioteka siedmiu polimerów z tworzyw sztucznych może stanowić jedynie około 10% wszystkich cząstek/kropek zobrazowanych pod mikroskopem SRS. Podobny poziom wskaźnika identyfikacji odnotowano w analizie mikroplastiku w wodzie butelkowanej przy użyciu mikroskopii wibracyjnej, co wskazuje na skomplikowany skład cząstek wewnątrz pozornie prostej próbki wody (Dodatek SI, Tabela S4). W tym sensie, jeśli założymy, że wszystkie wykryte cząstki organiczne pochodzą z tworzyw sztucznych [to samo założenie pociąga za sobą ilościowy wynik SEM-EDX lub barwienia czerwienią nilową (19, 74)], stężenie mikro-nano-plastiku może wynosić nawet 106 cząstek na litr. Jednak powszechne występowanie naturalnej materii organicznej z pewnością wymaga ostrożnego odróżnienia od spektroskopii ze specyficznością polimeru. Co więcej, dokładne badanie niezidentyfikowanych cząstek sugeruje inne aspekty, które dodatkowo zwiększają złożoność identyfikacji składu chemicznego. Na przykład, niektóre cząsteczki wykazują identyczne cechy z charakterystycznymi dwoma pikami (wiązanie estrowe C=O: 1730 cm-1; wiązanie podwójne C=C: 1615 cm-1) PET w regionie odcisków palców, ale prezentują dużą różnorodność pików wibracyjnych w regionie C-H o wysokiej częstotliwości (Dodatek SI, Rys. S8 a-d). Jest mało prawdopodobne, aby materiał polimerowy różny od PET wykazywał zarówno sygnatury wibracyjne C=O, jak i C=C, które idealnie pasują do standardowego widma PET. Bardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że są to małe heteroagregaty zawierające PET i inne składniki, a ich widmo SRS jest superpozycją widma z każdego składnika. Rzeczywiście, w przypadku niektórych większych, możemy nawet uchwycić przestrzenną niejednorodność chemiczną w agregatach (Dodatek SI, Rys. S8 a, e i i). Możliwe tworzenie się heteroagregatów między nanoplastikami lub inną naturalną materią organiczną od dawna uznawane jest za potencjalne wyzwanie w analizie nanoplastików i może wpływać na wyniki toksykologiczne w ramach ekspozycji biologicznej (11). Bezpośrednia wizualizacja takich heteroagregatów w rzeczywistych próbkach potwierdza te obawy. W przypadku innych możliwych heteroagregatów utworzonych bez PET, rygorystyczna identyfikacja będzie wymagała rozszerzenia biblioteki spektralnej i udoskonalenia algorytmów analitycznych dla mikroskopii SRS lub innych technik obrazowania wibracyjnego z rozszerzonymi oknami spektralnymi, aby sprostać wyzwaniom narzuconym przez masywną niejednorodność cząstek (27, 75, 76).

Innym ważnym spostrzeżeniem jest to, że rozkład wielkości cząstek zmienia się w zależności od różnych składów chemicznych, co sugeruje wzajemne powiązanie między morfologią cząstek a składem chemicznym. Zaobserwowana nieortogonalność między składem tworzywa sztucznego a morfologią cząstek podważa konwencjonalne założenie dotyczące charakterystyki mikro-nano tworzyw sztucznych na podstawie pomiarów zespołowych. Weźmy jako przykład wynik analizy marki C, pomiary zbiorcze mikro-nano tworzyw sztucznych mogą sugerować, że główną substancją jest PET z analizy składu, a większość cząstek tworzyw sztucznych ma rozmiary poniżej 500 nm z analizy morfologicznej. Zakładając, że te dwa wymiary są niezależnymi właściwościami, ludzie mogą odnieść wrażenie, że większość cząstek plastiku w butelkowanej wodzie marki C powinna być cząstkami PET o rozmiarze poniżej 500 nm. Jednak nasze wyniki analizy pojedynczych cząstek wykazują wyraźną rozbieżność: próbka okazuje się zawierać niewielką liczbę cząstek PET o wielkości około mikrona i dużą liczbę cząstek PS o wielkości poniżej 500 nm. Taka nieortogonalność może dostarczyć cennych informacji, które pozwolą zrozumieć, śledzić i ostatecznie zapobiegać możliwym źródłom zanieczyszczenia mikroplastikami. W szczególności w produkcji wody pitnej, zanieczyszczenie plastikiem jest potwierdzone na każdym etapie od studni do butelki (77). Odkryte różnice w wielkości różnych polimerów z tworzyw sztucznych mogą wskazywać cenne informacje na temat źródeł zanieczyszczenia podczas produkcji wody. Na przykład PET i PE, które są używane jako materiał opakowaniowy do wody butelkowanej dla wszystkich trzech analizowanych przez nas marek, mają podobne wzorce rozkładu wielkości, z główną populacją mikronowych rozmiarów w porównaniu do innych polimerów. Możliwym wyjaśnieniem jest to, że niektóre cząstki tego rodzaju są nowo uwalniane z opakowania butelki podczas transportu lub przechowywania, które są wiernie zatrzymywane w próbce wody. Inne polimery, takie jak PA, PP, PS i PVC, które nie są materiałem opakowaniowym, ale również zostały zidentyfikowane ze znaczną liczbą, najprawdopodobniej zostały wprowadzone przed lub podczas produkcji wody. PP i PA, które mają ten sam szeroki rozkład rozmiarów, są szeroko stosowane jako elementy wyposażenia lub koagulanty w uzdatnianiu wody (78). W szczególności PA jest najpopularniejszym materiałem membranowym stosowanym w odwróconej osmozie (79), która jest powszechną metodą oczyszczania wody wspólną dla wszystkich trzech marek. PVC i PS, które mają unikalny rozkład wielkości faworyzujący małe nanoplastiki, mogą wskazywać na źródło zanieczyszczenia jeszcze wcześniej. PVC jest najczęściej występującym rodzajem polimeru w wodzie surowej na podstawie analizy mikroplastików (77). PS jest znany jako materiał szkieletowy dla żywic jonowymiennych w oczyszczaniu wody (80). Możliwe jest, że duże cząstki PVC lub PS są usuwane przez membrany RO na późniejszym etapie oczyszczania wody, pozostawiając głównie nano populacje. Wreszcie, wzajemne powiązania między morfologią cząstek a składem chemicznym mają głębokie implikacje dla kwestii toksykologicznych. Jak sugerują badania nad nanocząsteczkami inżynieryjnymi i badania nad cząsteczkami z tworzyw sztucznych, toksyczność wywołana przez mikro-nanocząsteczki jest nie tylko zależna od dawki, ale także związana z właściwościami fizykochemicznymi cząsteczek i ich wpływem na interakcje komórkowe i wchłanianie (81, 82). W przypadku wody butelkowanej marki C, cytotoksyczność wywołana przez nanoplastiki PS plus niewielką liczbę mikroplastików PET byłaby prawdopodobnie inna niż efekt zakładany przez nanocząstki PET. Prawdziwa kompleksowa ocena toksyczności mikronanocząstek tworzyw sztucznych wymagałaby wielowymiarowej charakterystyki cząstek tworzyw sztucznych i integracji każdej pojedynczej cząstki tworzywa sztucznego w odniesieniu do ich rozbieżnych właściwości w zakresie składu chemicznego i morfologii cząstek. Obrazowanie pojedynczych cząstek z czułością nanocząstek i specyficznością dla tworzyw sztucznych dostarcza niezbędnych informacji, aby rozwiązać rosnące obawy dotyczące toksyczności. Nie tylko umożliwia profilowanie cząstek tworzyw sztucznych z dokładną kwantyfikacją ekspozycji, ale także ma unikalny potencjał do bezpośredniej wizualizacji interakcji cząstek z biologią. Dlatego też przewidujemy, że oparta na danych hiperspektralna platforma obrazowania SRS będzie nadal wypełniać lukę w wiedzy na temat zanieczyszczenia tworzywami sztucznymi na poziomie nano z rozszerzoną biblioteką spektralną do badania bardziej skomplikowanych próbek biologicznych i środowiskowych.

7. Materiały i metody

7.1. Mikroskopia hiperspektralna SRS.

Obrazowanie hiperspektralne SRS jest wykonywane w komercyjnym systemie skonstruowanym poprzez wysłanie femtosekundowego systemu laserowego o podwójnym wyjściu (InSight X3, Spectra-Physics) przez zintegrowany Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU, Newport Corporation) (38) i sprzężony z wielofotonowym laserowym mikroskopem skaningowym (FVMPE-RS, Olympus). Oprzyrządowanie i warunki obrazowania zostały szczegółowo opisane w Dodatku SI.

7.2. Przygotowanie próbki

Wzorce PS mikrosfer o różnych rozmiarach zostały zakupione od Thermo Fisher Invitrogen. Wzorce mikroplastiku PET, PP, PE, PVC i PA uzyskano przez rozdrobnienie plastikowych palet o wielkości poniżej cm na proszek za pomocą młynka do zamrażania. Cząsteczki zawieszone w wodzie RO są rozprowadzane i suszone na powierzchni szkiełka nakrywkowego przed zatopieniem w 1% żelu agarozowym przygotowanym z D2O do obrazowania SRS. Szczegóły opisano w Dodatku SI. Dwie butelki wody tej samej marki są filtrowane przez membranę Anodisc o wielkości porów 0,2 µm za pomocą starannie oczyszczonych szklanych aparatów zgodnie z procedurą opisaną w Dodatku SI. Membrana zbiorcza jest umieszczana zgodnie z Rys. 3B w celu obrazowania SRS. Szczegółowy protokół można znaleźć w Dodatku SI.  7.3. Analiza danych. Metody algorytmów dopasowania widmowego dostosowanych do SRS, generowania danych syntetycznych i automatycznego wykrywania mikro-nano-plastiku zostały szczegółowo opisane w Dodatku SI. Odpowiednie kody MATLAB są dostępne w serwisie GitHub pod następującym linkiem: https://github.com/qnxcarnation/SRS-tailored-Spectral-Matching-algorithm-for-plastic-identification.git.

Dostępność danych, materiałów i oprogramowania:

Kod MATLAB używany do symulacji, dopasowania widmowego i analizy plastycznej; surowe dane obrazowe zostały zdeponowane w GitHub i Figshare (https://github.com/qnxcarnation/SRS-tailored-Spectral-Matching-algorithm-for-plastic-identification.git (83); i https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24635793.v2) (84). Wszystkie inne dane są zawarte w manuskrypcie i/lub dodatku SI.

Podziękowania:

Dziękujemy naukowcom Tingran Wang i Mariam Avagyan za dyskusję na temat algorytmów. Dziękujemy za wsparcie ze strony Research Initiatives in Science and Engineering (RISE) Uniwersytetu Columbia, Hudson River Foundation, NIEHS Center for Environmental Health and Justice in Northern Manhattan (NIEHS P-30-ES009089) oraz Rutgers Center for Environmental Exposure and Disease (NIEHS P30-ES005022). Wkład autorów: N.Q., B.Y. i W.M. zaprojektowali badania; N.Q., H.D. i T.M.B. przeprowadzili badania; X.G. i X.L. wnieśli nowe odczynniki / narzędzia analityczne; N.Q., X.G., Q.C., P.S. i B.Y. przeanalizowali dane; i N.Q., P.S., B.Y. i W.M. napisali artykuł.

Konflikt interesów:

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Bibliografia:

  1. R. Geyer, J. R. Jambeck, K. L. Law, Production, use, and fate of all plastics ever made. Sci. Adv. 3, e1700782 (2017).
  2. X. Lim, Microplastics are everywhere—but are they harmful? Nature 593, 22–25 (2021).
  3. L. F. Amato-Lourenço et al., Presence of airborne microplastics in human lung tissue. J. Hazardous Mater. 416, 126124 (2021).
  4. A. Ragusa et al., Plasticenta: First evidence of microplastics in human placenta. Environ. Intern. 146, 106274 (2021).
  5. S. Wagne, T. Reemtsma, Things we know and don’t know about nanoplastic in the environment. Nat. Nanotechnol. 14, 300–301 (2019).
  6. Y. Luo et al., Quantitative tracing of uptake and transport of submicrometre plastics in crop plants using lanthanide chelates as a dual-functional tracer. Nat. Nanotechnol. 17, 424–431 (2022).
  7. X.-D. Sun et al., Differentially charged nanoplastics demonstrate distinct accumulation in Arabidopsis thaliana. Nat. Nanotechnol. 15, 755–760 (2020).
  8. D. M. Mitrano et al., Synthesis of metal-doped nanoplastics and their utility to investigate fate and behaviour in complex environmental systems. Nat. Nanotechnol. 14, 362–368 (2019).
  9. S. B. Fournier et al., Nanopolystyrene translocation and fetal deposition after acute lung exposure during late-stage pregnancy. Particle Fibre Toxicol. 17, 1–11 (2020).
  10. D. M. Mitrano, P. Wick, B. Nowack, Placing nanoplastics in the context of global plastic pollution. Nat. Nanotechnol. 16, 491–500 (2021).
  11. J. Gigault et al., Nanoplastics are neither microplastics nor engineered nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 16, 501–507 (2021).
  12. S. Behzadi et al., Cellular uptake of nanoparticles: Journey inside the cell. Chem. Soc. Rev. 46, 4218–4244 (2017).
  13. L. Schröter, N. Ventura, Nanoplastic toxicity: Insights and challenges from experimental model systems. Small 18, 2201680 (2022).
  14. C. F. Araujo, M. M. Nolasco, A. M. Ribeiro, P. J. Ribeiro-Claro, Identification of microplastics using Raman spectroscopy: Latest developments and future prospects. Water Res. 142, 426–440 (2018).
  15. N. P. Ivleva, Chemical analysis of microplastics and nanoplastics: Challenges, advanced methods, and perspectives. Chem. Rev. 121, 11886–11936 (2021).
  16. S. Primpke, M. Wirth, C. Lorenz, G. Gerdts, Reference database design for the automated analysis of microplastic samples based on Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Anal. Bioanal. Chem. 410, 5131–5141 (2018).
  17. A. Käppler et al., Analysis of environmental microplastics by vibrational microspectroscopy: FTIR, Raman or both? Anal. Bioanal. Chem. 408, 8377–8391 (2016).
  18. G. Renner, T. C. Schmidt, J. Schram, Analytical methodologies for monitoring micro (nano) plastics: Which are fit for purpose? Curr. Opin. Environ. Sci. Health 1, 55–61 (2018).
  19. P. Zuccarello et al., Exposure to microplastics (<10mum) associated to plastic bottles mineral water consumption: The first quantitative study. Water Res. 157, 365–371 (2019).
  20. I. Jakubowicz, J. Enebro, N. Yarahmadi, Challenges in the search for nanoplastics in the environment—A critical review from the polymer science perspective. Polym. Testing 93, 106953 (2021).
  21. A. Foetisch, M. Filella, B. Watts, L. H. Vinot, M. Bigalke, Identification and characterisation of individual nanoplastics by scanning transmission X-ray microscopy (STXM). J. Hazard. Mater. 426, 127804 (2022).
  22. D. Kurouski, A. Dazzi, R. Zenobi, A. Centrone, Infrared and Raman chemical imaging and spectroscopy at the nanoscale. Chem. Soc. Rev. 49, 3315–3347 (2020).
  23. I. C. ten Have et al., Photoinduced force microscopy as an efficient method towards the detection of nanoplastics. Chem. Methods 1, 205–209 (2021).
  24. C. W. Freudiger et al., Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science 322, 1857–1861 (2008).
  25. F. Hu, L. Shi, W. Min, Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat. Methods 16, 830–842 (2019).
  26. J.-X. Cheng, X. S. Xie, Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science 350, aaa8870 (2015).
  27. C. H. Camp Jr., M. T. Cicerone, Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat. Photonics 9, 295–305 (2015).
  28. R. C. Prince, R. R. Frontiera, E. O. Potma, Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chem. Rev. 117, 5070–5094 (2017).
  29. J. X. Cheng, W. Min, Y. Ozeki, D. Poll, Eds., Stimulated Raman Scattering Microscopy: Techniques and Applications (Elsevier, 2021).
  30. L. Zada et al., Fast microplastics identification with stimulated Raman scattering microscopy. J. Raman Spectr. 49, 1136–1144 (2018).
  31. S. P. Laptenok, C. Martin, L. Genchi, C. M. Duarte, C. Liberale, Stimulated Raman microspectroscopy as a new method to classify microfibers from environmental samples. Environ. Pollut. 267, 115640 (2020).
  32. W. Min, C. W. Freudiger, S. Lu, X. S. Xie, Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507 (2011).
  33. D. Fu, G. Holtom, C. Freudiger, X. Zhang, X. S. Xie, Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. J. Phys. Chem. B 117, 4634–4640 (2013).
  34. L. Wei, W. Min, Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. J. Phys. Chem. Lett. 9, 4294–4301 (2018).
  35. L. Li et al., Effective uptake of submicrometre plastics by crop plants via a crack-entry mode. Nat. Sustain. 3, 929–937 (2020).
  36. M. Shen et al., Recent advances in toxicological research of nanoplastics in the environment: A review. Environ. Pollut. 252, 511–521 (2019).
  37. Y. Li, Z. Wang, B. Guan, Separation and identification of nanoplastics in tap water. Environ. Res. 204, 112134 (2022).
  38. A. Zeytunyan, T. Baldacchini, R. Zadoyan, “Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII” in Module for Multiphoton High-Resolution Hyperspectral Imaging and Spectroscopy (SPIE, 2018), pp. 48–55.
  39. B. Manifold, B. Figueroa, D. Fu, “Hyperspectral SRS imaging via spectral focusing” in Stimulated Raman Scattering Microscopy, D. Polli, J.-X. Cheng, W. Min, Y. Ozeki, Eds. (Elsevier, 2022), pp. 69–79.
  40. J.-L. Xu, K. V. Thomas, Z. Luo, A. A. Gowen, FTIR and Raman imaging for microplastics analysis: State of the art, challenges and prospects. TrAC Trends Anal. Chem. 119, 115629 (2019).
  41. D. Schymanski et al., Analysis of microplastics in drinking water and other clean water samples with micro-Raman and micro-infrared spectroscopy: Minimum requirements and best practice guidelines. Anal. Bioanal. Chem. 413, 5969–5994 (2021).
  42. A. Z. Samuel et al., On selecting a suitable spectral matching method for automated analytical applications of Raman spectroscopy. ACS Omega 6, 2060–2065 (2021).
  43. C.-S. Liao et al., Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Sci. Appl. 4, e265–e265 (2015).
  44. J. Réhault et al., Broadband stimulated Raman scattering with Fourier-transform detection. Opt. Expr. 23, 25235–25246 (2015).
  45. C. H. Camp Jr. et al., High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat. Photonics 8, 627–634 (2014).
  46. R. J. Chen, M. Y. Lu, T. Y. Chen, D. F. Williamson, F. Mahmood, Synthetic data in machine learning for medicine and healthcare. Nat. Biomed. Eng. 5, 493–497 (2021).
  47. T. C. Hollon et al., Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nat. Med. 26, 52–58 (2020).
  48. H. Lin et al., Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat. Commun. 12, 1–12 (2021).
  49. B. Manifold, S. Men, R. Hu, D. Fu, A versatile deep learning architecture for classification and label-free prediction of hyperspectral images. Nat. Machine Intell. 3, 306–315 (2021).
  50. Q. Liu et al., Microplastics and nanoplastics: Emerging contaminants in food. J. Agricul. Food Chem. 69, 10450–10468 (2021).
  51. C. Vitali, R. Peters, H.-G. Janssen, M. W. F. Nielen, Microplastics and nanoplastics in food, water, and beverages; part I. Occurrence. TrAC Trends Anal. Chem. 159, 116670 (2022).
  52. D. Li et al., Microplastic release from the degradation of polypropylene feeding bottles during infant formula preparation. Nat. Food 1, 746–754 (2020).
  53. Y. Su et al., Steam disinfection releases micro(nano)plastics from silicone-rubber baby teats as examined by optical photothermal infrared microspectroscopy. Nat. Nanotechnol. 17, 76–85 (2022).
  54. L. M. Hernandez et al., Plastic teabags release billions of microparticles and nanoparticles into tea. Environ. Sci. Technol. 53, 12300–12310 (2019).
  55. C. D. Zangmeister, J. G. Radney, K. D. Benkstein, B. Kalanyan, Common single-use consumer plastic products release trillions of Sub-100 nm nanoparticles per liter into water during normal use. Environ. Sci. Technol. 56, 5448–5455 (2022).
  56. Q. Zhang et al., A review of microplastics in table salt, drinking water, and air: Direct human exposure. Environ. Sci. Technol. 54, 3740–3751 (2020).
  57. I. Gambino, F. Bagordo, T. Grassi, A. Panico, A. De Donno, Occurrence of microplastics in tap and bottled water: Current knowledge. Int. J. Environ. Res. Public Health 19, 5283 (2022).
  58. A. Yusuf et al., Updated review on microplastics in water, their occurrence, detection, measurement, environmental pollution, and the need for regulatory standards. Environ. Pollut. 292, 118421 (2022).
  59. S. A. Mason, V. G. Welch, J. Neratko, Synthetic polymer contamination in bottled water. Front. Chem. 6, 407 (2018).
  60. A. A. Koelmans et al., Microplastics in freshwaters and drinking water: Critical review and assessment of data quality. Water Res. 155, 410–422 (2019).
  61. B. E. Ossmann et al., Small-sized microplastics and pigmented particles in bottled mineral water. Water Res. 141, 307–316 (2018).
  62. B. E. Oßmann, Microplastics in drinking water? Present state of knowledge and open questions. Curr. Opin. Food Sci. 41, 44–51 (2021).
  63. Y. Huang et al., Characteristics of nano-plastics in bottled drinking water. J. Hazard. Mater. 424, 127404 (2022).
  64. I. Park, W. Yang, D.-K. Lim, Current status of organic matters in bottled drinking water in Korea. ACS ES&T Water 2, 738–748 (2022).
  65. J. J. Rennick, A. P. Johnston, R. G. Parton, Key principles and methods for studying the endocytosis of biological and nanoparticle therapeutics. Nat. Nanotechnol. 16, 266–276 (2021).
  66. Y. He, K. Park, Effects of the microparticle shape on cellular uptake. Mol. Pharm. 13, 2164–2171 (2016).
  67. T. Gebel et al., Manufactured nanomaterials: Categorization and approaches to hazard assessment. Arch. Toxicol. 88, 2191–2211 (2014).
  68. A. F. Hubbs et al., Nanotoxicology—A pathologist’s perspective. Toxicol. Pathol. 39, 301–324 (2011).
  69. D. Schymanski, C. Goldbeck, H.-U. Humpf, P. Fürst, Analysis of microplastics in water by micro-Raman spectroscopy: Release of plastic particles from different packaging into mineral water. Water Res. 129, 154–162 (2018).
  70. D. Kankanige, S. Babel, Smaller-sized micro-plastics (MPs) contamination in single-use PET-bottled water in Thailand. Sci. Total Environ. 717, 137232 (2020).
  71. K. D. Cox et al., Human consumption of microplastics. Environ. Sci. Technol. 53, 7068–7074 (2019).
  72. S. B. Fournier et al., Nanopolystyrene translocation and fetal deposition after acute lung exposure during late-stage pregnancy. Particle Fibre Toxicol. 17, 1–11 (2020).
  73. A. Banerjee, W. L. Shelver, Micro-and nanoplastic induced cellular toxicity in mammals: A review. Sci. Total Environ. 755, 142518 (2021).
  74. T. Stanton et al., Exploring the efficacy of Nile red in microplastic quantification: A costaining approach. Environ. Sci. Technol. Lett. 6, 606–611 (2019).
  75. Y. Bai, J. Yin, J.-X. Cheng, Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci. Adv. 7, eabg1559 (2021).
  76. A. Dazzi, C. B. Prater, AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chem. Rev. 117, 5146–5173 (2017).
  77. J. Weisser et al., From the well to the bottle: Identifying sources of microplastics in mineral water. Water 13, 841 (2021).
  78. W. H. Organization, Microplastics in drinking-water (2019).
  79. G. M. Geise, Why polyamide reverse-osmosis membranes work so well. Science 371, 31–32 (2021).
  80. F. G. Vagliasindi, V. Belgiorno, R. M. Napoli, “Water treatment in remote and rural areas: A conceptual screening protocol for appropriate pou/poe technologies” in Environmental Engineering and Renewable Energy, R. Gavasci, S. Zandaryaa, Eds. (Elsevier, 1998), pp. 329–336.
  81. H. F. Krug, P. Wick, Nanotoxicology: An interdisciplinary challenge. Angew. Chem. Intern. Ed. 50, 1260–1278 (2011).
  82. C. Domingues et al., Where is nano today and where is it headed? A review of nanomedicine and the dilemma of nanotoxicology. ACS Nano 16, 9994–10041 (2022).
  83. N. Qian, SRS_plastic_identification_code.zip. Github. https://github.com/qnxcarnation/SRS-tailored-Spectral-Matching-algorithm-for-plastic-identification. Deposited 8 May 2023.
  84. N. Qian, MicronanoplaticsBottledWater_SRSimaging_originaldataset.zip. Figshare. https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24635793.v2. Deposited 26 November 2023.